PUMA在小鼠颗粒细胞凋亡中功能和作用机制研究
PUMA在小鼠颗粒细胞凋亡中功能和作用机制研究[20200510204455]
摘要：卵巢是一个动力学器官，99%卵泡发生卵泡闭锁，颗粒细胞凋亡在此过程中发挥重要作用。PUMA(p53 up-regulated modulator apoptosis )是一个只有BH3结构域的促凋亡蛋白，参与了DNA损伤、应激、感染等各种各样刺激诱导的细胞凋亡的过程。本研究以小鼠为模型，研究PUMA在颗粒细胞凋亡过程中的功能和作用机制。结果表明：用双氧水处理（100μM）颗粒细胞，可以诱导细胞凋亡；若过表达PUMA，则细胞凋亡增加；若培养的颗粒细胞中加入PUMA抑制剂，则细胞凋亡减少。同时，在氧化应激诱导的颗粒细胞凋亡中，PUMA在mRNA和蛋白水平上都表达上调。因此，在颗粒细胞凋亡过程中，我们发现了一个新型调控蛋白，为卵巢的干预调控奠定了基础。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:颗粒细胞；PUMA；细胞凋亡
目录
摘要4
关键词4
Abstract4
Key words4
引言5
1材料与方法5
1.1实验小鼠的饲养和管理5
1.2小鼠卵泡的分离与放出颗粒细胞6
1.2.1试验材料6
1.2.2试验方法6
1.3颗粒细胞质粒提取6
1.4颗粒细胞转染6
1.4.1试验材料7
1.4.2试验方法7
1.5颗粒细胞的凋亡检测7
1.6Real-time PCR7
1.6.1试验材料7
1.6.2 试验方法7
1.6.3 cDNA合成7
1.6.4 荧光定量PCR反应体系8
1.6.5荧光定量PCR反应程序8
1.6.6注意事项8
1.7 Western Blot8
1.7.1 试验材料8
1.7.2 试验方法9
2结果与分析9
2.1 质粒提取结果9
2.2PUMA在凋亡通路中表达10
2.3PUMA过表达结果13
2.4 抑制PUMA表达结果14
3讨论 14
4结论 16
致谢17
参考文献17
PUMA在小鼠颗粒细胞凋亡中功能和作用机制研究
引言
引言：本章选取小鼠为试验动物，通过对小鼠卵泡闭锁过程中的颗粒细胞的研究，了解PUMA蛋白在小鼠颗粒细胞凋亡过程中的功能和作用机制，并且在该过程中发现新的调控者，进一步控制卵泡闭锁。主要进行几项研究：首先，在mRNA和蛋白水平 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
上，检测PUMA在小鼠卵巢颗粒细胞中的表达。其次，利用过表达技术，在体外颗粒细胞中过表达PUMA，研究PUMA在小鼠颗粒细胞中的功能和作用机制。最后，利用PUMA抑制剂，在体外颗粒细胞中抑制PUMA表达，研究PUMA在小鼠颗粒细胞中的功能和作用机制。技术路线如下图示（图2-1）。
图2-1 实验技术路线
1 材料与方法
1．1 实验小鼠的饲养管理
从外引进幼鼠进行饲养，交配，繁殖。根据实验室白鼠饲养手册进行饲养，具体操作过程如下。
（1）基本饲养条件
饲养小鼠的基本条件包括鼠舍及笼具设备。根据小鼠的生物学特性以及习性，小鼠对房舍的建筑和环境条件的要求比较严格。本实验小鼠采用无毒塑料鼠盒，不锈钢丝笼盖，金属架。笼架可移动，并可经受多种方法消毒灭菌。按照体重20 g的小鼠计算，每只小鼠需要饲养笼具面积0.009～0.063m2，分为5～10只小笼饲养，已配过种的雄鼠应单独饲养。笼具上配备饮水器具，以玻璃瓶或塑料瓶配以瓶塞组成，瓶塞中间打孔插入铝管作为饮水管，饮水管的内径6毫米，外径8毫米，容量为250ml。笼具内以清洁、干燥的小刨花作为垫料。笼具摆放在鼠架上。实验室内温度控制在22℃，湿度在50%-60%之间，配有空气调节器。照明一般早上8点开灯至下午6点。
（2）饲料和饮水
小鼠饲喂全价营养颗粒饲料，饲料具一定的硬度，便于小鼠磨牙。小鼠和种鼠的饲料所含蛋白质成分较高。小鼠饲喂高温高压处理后的水。每周调料三次，水一缺少立即添加，每周换水3次，且每次都消毒处理饮水器具。
（3）卫生与消毒
每周更换两次垫料。换垫料时饲养盒一起移去，在专门的房间倒垫料。垫料在使用前经高压消毒灭菌。每周打扫实验室，保持室内外整洁，门窗、墙壁、地面等无尘土。每月都进行消毒。定期检查小鼠的健康状况。
1.2 小鼠卵泡的分离与颗粒细胞释放
1.2.1 试验材料
动物：3周龄小鼠，46只，分为四笼，数量分别为（10,10,11,15）
试剂：孕马血清（PMSG），100单位计量。稀释液：盐水，水（孕马血清中自带）。培养基：DMEM/F-12。
仪器：二氧化碳培养箱：37℃，5%CO2浓度。超净工作台。
1.2.2 试验方法
首先用PMSG注射于3周龄大雌性小鼠，使其发情。
然后进行腔前卵泡的分离与采集:将雌性小鼠用颈椎脱臼法处死,消毒腹部皮肤,腹位无菌摘取卵巢,放入基础培养液中。在实体显微镜下剥离卵巢周围附带组织。将卵巢浸入含胶原酶的培养液中,用异物针撕碎卵巢,分离卵泡。15min内完成操作。吸卵针吸取单个腔前卵泡,用培养液洗涤5~6次,供培养用。
最后放出颗粒细胞：在实体显微镜下用针头剌破有腔卵泡放出颗粒细胞, PBS洗涤，过滤，细胞放在装有小牛血清（10%）的DMEM/F-12培养液中，用5%CO2、95%空气充分饱和的灭菌石蜡油覆盖,放37℃、饱和湿度、5%CO2二氧化碳培养箱中,培养2d左右即可长成单层颗粒细胞。
1.3质粒提取
1. 200mL含有50mg/mL氨苄或30mg/mL卡纳的培养基中振摇过夜（12-14h）
2. 50mL离心管，4℃，4000rpm *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
,10min收集2份细胞
3. 每管加5mLSTE悬浮细胞后，4℃，4000rpm,10min收集细胞，置-20℃贮存10min
4. 室温解冻后，每管加4mL冰预冷的溶液Ⅰ，重悬细胞
5. 室温下每管加8mL溶液Ⅱ后充分混匀，室温静置5-10min
6. 每管加6mL冰预冷的溶液Ⅲ，充分混匀，冰浴静置10min
7. 4℃，11000rpm,30min收集裂解上清液（用纱布过滤）
8. 每管加0.6倍体积异丙醇，室温静置10min
9. 4℃，8000rpm,15min收集核酸沉淀，每管加5mL70%乙醇清洗
10. 4℃，8000rpm,5min收集沉淀，晾10-15min，直至管壁无液滴
11. 每管加2mLTE溶解核酸，4℃或冰浴静置30min
12. 每管加2mL7.5mol/L乙酸铵溶液，冰浴静置10min
13. 4℃，10000rpm,10min收集上清，每管加4mL异丙醇，混匀
14. 4℃，10000rpm,10min收集沉淀，4-5mL70%乙醇清洗沉淀
15. 4℃，10000rpm,5min收集沉淀，晾10-15min，直至管壁无液滴
16. 每管加1mLTE溶解核酸，4℃或冰浴静置30min
17. 两份溶液和到一管，加8μL10mg/mLRNase A，混匀转入EP管（每管转入500μL），37℃水浴静置30-60min
18. 每管加250μL酚，250μL仿醇（24:1）抽提，4℃，12000rpm,10min，收集上清水相19. 每管加aμL仿醇（24:1）抽提，4℃，12000rpm,10min，收集上清水相
20. 每管加2bμL-20℃乙醇和0.1bμL乙酸钠溶液，-20℃静置过夜
（3）加1μl(200U)TIANScript M-MLV，轻轻用移液器混匀；
图2-6 H2o2诱导细胞凋亡
摘要：卵巢是一个动力学器官，99%卵泡发生卵泡闭锁，颗粒细胞凋亡在此过程中发挥重要作用。PUMA(p53 up-regulated modulator apoptosis )是一个只有BH3结构域的促凋亡蛋白，参与了DNA损伤、应激、感染等各种各样刺激诱导的细胞凋亡的过程。本研究以小鼠为模型，研究PUMA在颗粒细胞凋亡过程中的功能和作用机制。结果表明：用双氧水处理（100μM）颗粒细胞，可以诱导细胞凋亡；若过表达PUMA，则细胞凋亡增加；若培养的颗粒细胞中加入PUMA抑制剂，则细胞凋亡减少。同时，在氧化应激诱导的颗粒细胞凋亡中，PUMA在mRNA和蛋白水平上都表达上调。因此，在颗粒细胞凋亡过程中，我们发现了一个新型调控蛋白，为卵巢的干预调控奠定了基础。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:颗粒细胞；PUMA；细胞凋亡
目录
摘要4
关键词4
Abstract4
Key words4
引言5
1材料与方法5
1.1实验小鼠的饲养和管理5
1.2小鼠卵泡的分离与放出颗粒细胞6
1.2.1试验材料6
1.2.2试验方法6
1.3颗粒细胞质粒提取6
1.4颗粒细胞转染6
1.4.1试验材料7
1.4.2试验方法7
1.5颗粒细胞的凋亡检测7
1.6Real-time PCR7
1.6.1试验材料7
1.6.2 试验方法7
1.6.3 cDNA合成7
1.6.4 荧光定量PCR反应体系8
1.6.5荧光定量PCR反应程序8
1.6.6注意事项8
1.7 Western Blot8
1.7.1 试验材料8
1.7.2 试验方法9
2结果与分析9
2.1 质粒提取结果9
2.2PUMA在凋亡通路中表达10
2.3PUMA过表达结果13
2.4 抑制PUMA表达结果14
3讨论 14
4结论 16
致谢17
参考文献17
PUMA在小鼠颗粒细胞凋亡中功能和作用机制研究
引言
引言：本章选取小鼠为试验动物，通过对小鼠卵泡闭锁过程中的颗粒细胞的研究，了解PUMA蛋白在小鼠颗粒细胞凋亡过程中的功能和作用机制，并且在该过程中发现新的调控者，进一步控制卵泡闭锁。主要进行几项研究：首先，在mRNA和蛋白水平 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
上，检测PUMA在小鼠卵巢颗粒细胞中的表达。其次，利用过表达技术，在体外颗粒细胞中过表达PUMA，研究PUMA在小鼠颗粒细胞中的功能和作用机制。最后，利用PUMA抑制剂，在体外颗粒细胞中抑制PUMA表达，研究PUMA在小鼠颗粒细胞中的功能和作用机制。技术路线如下图示（图2-1）。
图2-1 实验技术路线
1 材料与方法
1．1 实验小鼠的饲养管理
从外引进幼鼠进行饲养，交配，繁殖。根据实验室白鼠饲养手册进行饲养，具体操作过程如下。
（1）基本饲养条件
饲养小鼠的基本条件包括鼠舍及笼具设备。根据小鼠的生物学特性以及习性，小鼠对房舍的建筑和环境条件的要求比较严格。本实验小鼠采用无毒塑料鼠盒，不锈钢丝笼盖，金属架。笼架可移动，并可经受多种方法消毒灭菌。按照体重20 g的小鼠计算，每只小鼠需要饲养笼具面积0.009～0.063m2，分为5～10只小笼饲养，已配过种的雄鼠应单独饲养。笼具上配备饮水器具，以玻璃瓶或塑料瓶配以瓶塞组成，瓶塞中间打孔插入铝管作为饮水管，饮水管的内径6毫米，外径8毫米，容量为250ml。笼具内以清洁、干燥的小刨花作为垫料。笼具摆放在鼠架上。实验室内温度控制在22℃，湿度在50%-60%之间，配有空气调节器。照明一般早上8点开灯至下午6点。
（2）饲料和饮水
小鼠饲喂全价营养颗粒饲料，饲料具一定的硬度，便于小鼠磨牙。小鼠和种鼠的饲料所含蛋白质成分较高。小鼠饲喂高温高压处理后的水。每周调料三次，水一缺少立即添加，每周换水3次，且每次都消毒处理饮水器具。
（3）卫生与消毒
每周更换两次垫料。换垫料时饲养盒一起移去，在专门的房间倒垫料。垫料在使用前经高压消毒灭菌。每周打扫实验室，保持室内外整洁，门窗、墙壁、地面等无尘土。每月都进行消毒。定期检查小鼠的健康状况。
1.2 小鼠卵泡的分离与颗粒细胞释放
1.2.1 试验材料
动物：3周龄小鼠，46只，分为四笼，数量分别为（10,10,11,15）
试剂：孕马血清（PMSG），100单位计量。稀释液：盐水，水（孕马血清中自带）。培养基：DMEM/F-12。
仪器：二氧化碳培养箱：37℃，5%CO2浓度。超净工作台。
1.2.2 试验方法
首先用PMSG注射于3周龄大雌性小鼠，使其发情。
然后进行腔前卵泡的分离与采集:将雌性小鼠用颈椎脱臼法处死,消毒腹部皮肤,腹位无菌摘取卵巢,放入基础培养液中。在实体显微镜下剥离卵巢周围附带组织。将卵巢浸入含胶原酶的培养液中,用异物针撕碎卵巢,分离卵泡。15min内完成操作。吸卵针吸取单个腔前卵泡,用培养液洗涤5~6次,供培养用。
最后放出颗粒细胞：在实体显微镜下用针头剌破有腔卵泡放出颗粒细胞, PBS洗涤，过滤，细胞放在装有小牛血清（10%）的DMEM/F-12培养液中，用5%CO2、95%空气充分饱和的灭菌石蜡油覆盖,放37℃、饱和湿度、5%CO2二氧化碳培养箱中,培养2d左右即可长成单层颗粒细胞。
1.3质粒提取
1. 200mL含有50mg/mL氨苄或30mg/mL卡纳的培养基中振摇过夜（12-14h）
2. 50mL离心管，4℃，4000rpm *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
,10min收集2份细胞
3. 每管加5mLSTE悬浮细胞后，4℃，4000rpm,10min收集细胞，置-20℃贮存10min
4. 室温解冻后，每管加4mL冰预冷的溶液Ⅰ，重悬细胞
5. 室温下每管加8mL溶液Ⅱ后充分混匀，室温静置5-10min
6. 每管加6mL冰预冷的溶液Ⅲ，充分混匀，冰浴静置10min
7. 4℃，11000rpm,30min收集裂解上清液（用纱布过滤）
8. 每管加0.6倍体积异丙醇，室温静置10min
9. 4℃，8000rpm,15min收集核酸沉淀，每管加5mL70%乙醇清洗
10. 4℃，8000rpm,5min收集沉淀，晾10-15min，直至管壁无液滴
11. 每管加2mLTE溶解核酸，4℃或冰浴静置30min
12. 每管加2mL7.5mol/L乙酸铵溶液，冰浴静置10min
13. 4℃，10000rpm,10min收集上清，每管加4mL异丙醇，混匀
14. 4℃，10000rpm,10min收集沉淀，4-5mL70%乙醇清洗沉淀
15. 4℃，10000rpm,5min收集沉淀，晾10-15min，直至管壁无液滴
16. 每管加1mLTE溶解核酸，4℃或冰浴静置30min
17. 两份溶液和到一管，加8μL10mg/mLRNase A，混匀转入EP管（每管转入500μL），37℃水浴静置30-60min
18. 每管加250μL酚，250μL仿醇（24:1）抽提，4℃，12000rpm,10min，收集上清水相19. 每管加aμL仿醇（24:1）抽提，4℃，12000rpm,10min，收集上清水相
20. 每管加2bμL-20℃乙醇和0.1bμL乙酸钠溶液，-20℃静置过夜
（3）加1μl(200U)TIANScript M-MLV，轻轻用移液器混匀；
图2-6 H2o2诱导细胞凋亡
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