硫辛酸对肝脏炎症状态及氧化应激状态的作用
硫辛酸对肝脏炎症状态及氧化应激状态的作用[20200507185733]
摘要：LPS是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，当其大量进入生物体内，会引发炎症以及氧化应激反应，氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。本实验以C57BL/6雄性小鼠（6周龄，20g）为研究目标，检测LPS刺激状态下，LA+LPS小鼠和LPS小鼠肝脏组织中7种反应应激状况的标记物的变化，以期能确定LA对小鼠的氧化应激反应及炎症表现所产生的作用。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
关键字:氧化应激脂多糖肝脏硫辛酸
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 实验动物2
1.1.2 引物2
1.1.3 试剂2
1.1.4 仪器2
1.2 方法 2
1.1.1 实验动物的处理2
1.2.2 总RNA的提取2
1.2.3 反转录3
1.2.4 引物设计3
1.2.5 荧光定量PCR（Real-time PCR）3
2 结果与分析4 2.1 炎症因子的变化4
2.1.1 TLR44
2.1.2 NF-κB p654
2.1.3 IL-1β5
2.2 对氧化应激反应的作用5
2.2.1 SOD15
2.2.2 SOD26
2.2.3 GPX16
2.2.4 catalase7
3 标记物含量的意义7
3.1 炎症因子8
3.1.1 TLR48
3.1.2 NF-κB p659
3.1.3 IL-1β9
3.2 关于氧化应激的标记物9
3.2.1 SOD19
3.2.2 SOD210
3.2.3 GPX110
3.2.4 catalase10
4 讨论11
本实验的研究意义11
致谢11
参考文献12
硫辛酸对肝脏炎症状态及氧化 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
应激状态的作用
引言
引言:硫辛酸(英文为Alpha-Lipoic?Acid，简称为LA)是在人全身细胞中存在的一种脂肪酸，担任的任务是让细胞活化，也就是俗称的抗氧化物质。全球顶尖的硫辛酸和抗氧化剂权威美国加州大学柏克莱分校的帕克博士(Dr.?Lester?Packer)发现，硫辛酸不像别的抗氧化剂在体内只有一项特别的任务，它算是一种自由基，能在其它抗氧化剂缺乏时为之替代，它具有400倍的维他命C和E的抗氧化作用，如与体内的其它抗氧化因素如CoQ10及维他命Ｃ及Ｅ做成复方的话，还能更活化其它抗氧化剂的作用，且硫辛酸的作用力也比其它抗氧化剂来得持久。[1]本实验通过PCR技术，确定几种反应应激状况的标记物的变化，来推测硫辛酸对于炎症的影响及作用。而脂多糖作为一种外源性的炎症因子，会引发明显的炎症反应及氧化应激反应。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1 实验动物
C57BL/6雄性小鼠（6周龄，20g）
1.1.2引物
参考已发表的SOD1，SOD2，GPX1,catalase,TLR4, NF-κB p65，IL-1β基因核苷酸序列，利用Primer 6.0软件分别设计合成两对引物，用于扩增基因上主要抗原表位区的两个核酸片段.
1.1.3 试剂
TRIzol,氯仿，异丙醇，DEPC处理过的3d水，DNase I，10×DNase I Buffer,, M-MLV Buffer, M-MLV，RNAse inhibitor Random primer上游引物，下游引物，SYBR荧光染料，高压过的3dH2O
1.1.4 仪器
细胞破碎仪，通风橱，水浴锅，荧光定量PCR仪，离心机，旋涡混匀器，超净工作台
1.2方法
1.2.1实验动物的处理
取22只C57BL/6雄性小鼠（6周龄，20g）适应一周，分为三组，CON组6只，LPS组8只，LA+LPS组8只。一周后每天上午8：30进行腹腔注射，CON组注射saline，LPS组注射saline，LA+LPS组注射100mg/kg LA,连续注射5天。第5天注射1h后，CON组注射saline，LPS组注射5mg/kg LPS，LA+LPS注射组注射5mg/kg LPS，24h后处死采样。
1.2.2 总RNA的提取
TRIzol总RNA提取试剂盒提取肝脏总RNA后，DNaseⅠ去除总RNA中的基因组DNA，用NanoDrop分光光度计 (ND-1000) 测定总RNA浓度和纯度（OD260/OD280 = 1.5～2.0）。取4 μg总RNA，1.4%琼脂糖-甲醛变性凝胶电泳，EB染色后用Kodak 1D电泳凝胶成像系统分析RNA条带。如果条带清晰，无拖尾现象，且28S与18S条带灰度之比约为2:1，则表明RNA无降解，质量可靠，否则该RNA样品不能使用，必须重新提取。
1.2.3 反转录
用随机引物对所有样品的mRNA进行反转操作，获得各样品mRNA的cDNA。RT反应为25 μL体系，包括2 μg总RNA，1 μg Random primer，加DEPC-treated H2O至15 μL，70°C变性5 min， *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
立即放冰上冷却，再加25 U RNAse inhibitor，200 U M-MLV，5μL 5×M-MLV Buffer，1.25μL 10mM dNTPs，补充DEPC-treated H2O至25 μL，37°C反应60 min。同时用不加反转录酶的反转录体系作为阴性对照，用于检测总RNA样品中是否有基因组DNA污染。RT产物保存-20°C用于PCR检测。
1.2.4 引物设计
引物根据NCBI上鼠的相关mRNA序列设计，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列见下表。
目的基因 Target gene 引物序列 Primer sequence (5’ to 3’)
COD1 F: GCTTCTCGTCTTGCTCTC
R: TCCTGACAACACAACTGG
COD2 F: AGACCTGCCTTACGACTAT
R: AGAGCGACCTGAGTTGTA
GPX1 F: CACCGTGTATGCCTTCTC
R: TTCATTCTTGCCATTCTCCT
catalase F: TCAGGTGCGGACATTCTA
R: ATTGCGTTCTTAGGCTTCT
TLR4 F: TTCACCTCTGCCTTCACT
通过上述公式计算出每一个样本目标基因的表达，通过PPIA校正后相对于对照组的目标基因表达的倍数。
将每个待测样品的cDNA等体积混合，用混合样对反应条件进行优化。其中包括目的基因和内标基因的引物设计和合成、试剂验证、目的基因确认、内标基因有效性验证及最佳退火温度、引物浓度和最佳实验条件评估等。反应体系为 10 μL：2 μL 经 25倍稀释RT 产物（可稀释），上游和下游引物各 0.5μmol/L，12.5 μL 2 × SYBR? Green Real-time PCR Marster Mix，用灭菌三蒸水补足至 25 μL，执行以下PCR反应程序：95°C变性1 min，95°C变性30 sec，64°C退火30 sec，72°C 延伸20 sec，40个循环。
摘要：LPS是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，当其大量进入生物体内，会引发炎症以及氧化应激反应，氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用，并被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素。本实验以C57BL/6雄性小鼠（6周龄，20g）为研究目标，检测LPS刺激状态下，LA+LPS小鼠和LPS小鼠肝脏组织中7种反应应激状况的标记物的变化，以期能确定LA对小鼠的氧化应激反应及炎症表现所产生的作用。
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关键字:氧化应激脂多糖肝脏硫辛酸
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 实验动物2
1.1.2 引物2
1.1.3 试剂2
1.1.4 仪器2
1.2 方法 2
1.1.1 实验动物的处理2
1.2.2 总RNA的提取2
1.2.3 反转录3
1.2.4 引物设计3
1.2.5 荧光定量PCR（Real-time PCR）3
2 结果与分析4 2.1 炎症因子的变化4
2.1.1 TLR44
2.1.2 NF-κB p654
2.1.3 IL-1β5
2.2 对氧化应激反应的作用5
2.2.1 SOD15
2.2.2 SOD26
2.2.3 GPX16
2.2.4 catalase7
3 标记物含量的意义7
3.1 炎症因子8
3.1.1 TLR48
3.1.2 NF-κB p659
3.1.3 IL-1β9
3.2 关于氧化应激的标记物9
3.2.1 SOD19
3.2.2 SOD210
3.2.3 GPX110
3.2.4 catalase10
4 讨论11
本实验的研究意义11
致谢11
参考文献12
硫辛酸对肝脏炎症状态及氧化 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
应激状态的作用
引言
引言:硫辛酸(英文为Alpha-Lipoic?Acid，简称为LA)是在人全身细胞中存在的一种脂肪酸，担任的任务是让细胞活化，也就是俗称的抗氧化物质。全球顶尖的硫辛酸和抗氧化剂权威美国加州大学柏克莱分校的帕克博士(Dr.?Lester?Packer)发现，硫辛酸不像别的抗氧化剂在体内只有一项特别的任务，它算是一种自由基，能在其它抗氧化剂缺乏时为之替代，它具有400倍的维他命C和E的抗氧化作用，如与体内的其它抗氧化因素如CoQ10及维他命Ｃ及Ｅ做成复方的话，还能更活化其它抗氧化剂的作用，且硫辛酸的作用力也比其它抗氧化剂来得持久。[1]本实验通过PCR技术，确定几种反应应激状况的标记物的变化，来推测硫辛酸对于炎症的影响及作用。而脂多糖作为一种外源性的炎症因子，会引发明显的炎症反应及氧化应激反应。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1 实验动物
C57BL/6雄性小鼠（6周龄，20g）
1.1.2引物
参考已发表的SOD1，SOD2，GPX1,catalase,TLR4, NF-κB p65，IL-1β基因核苷酸序列，利用Primer 6.0软件分别设计合成两对引物，用于扩增基因上主要抗原表位区的两个核酸片段.
1.1.3 试剂
TRIzol,氯仿，异丙醇，DEPC处理过的3d水，DNase I，10×DNase I Buffer,, M-MLV Buffer, M-MLV，RNAse inhibitor Random primer上游引物，下游引物，SYBR荧光染料，高压过的3dH2O
1.1.4 仪器
细胞破碎仪，通风橱，水浴锅，荧光定量PCR仪，离心机，旋涡混匀器，超净工作台
1.2方法
1.2.1实验动物的处理
取22只C57BL/6雄性小鼠（6周龄，20g）适应一周，分为三组，CON组6只，LPS组8只，LA+LPS组8只。一周后每天上午8：30进行腹腔注射，CON组注射saline，LPS组注射saline，LA+LPS组注射100mg/kg LA,连续注射5天。第5天注射1h后，CON组注射saline，LPS组注射5mg/kg LPS，LA+LPS注射组注射5mg/kg LPS，24h后处死采样。
1.2.2 总RNA的提取
TRIzol总RNA提取试剂盒提取肝脏总RNA后，DNaseⅠ去除总RNA中的基因组DNA，用NanoDrop分光光度计 (ND-1000) 测定总RNA浓度和纯度（OD260/OD280 = 1.5～2.0）。取4 μg总RNA，1.4%琼脂糖-甲醛变性凝胶电泳，EB染色后用Kodak 1D电泳凝胶成像系统分析RNA条带。如果条带清晰，无拖尾现象，且28S与18S条带灰度之比约为2:1，则表明RNA无降解，质量可靠，否则该RNA样品不能使用，必须重新提取。
1.2.3 反转录
用随机引物对所有样品的mRNA进行反转操作，获得各样品mRNA的cDNA。RT反应为25 μL体系，包括2 μg总RNA，1 μg Random primer，加DEPC-treated H2O至15 μL，70°C变性5 min， *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
立即放冰上冷却，再加25 U RNAse inhibitor，200 U M-MLV，5μL 5×M-MLV Buffer，1.25μL 10mM dNTPs，补充DEPC-treated H2O至25 μL，37°C反应60 min。同时用不加反转录酶的反转录体系作为阴性对照，用于检测总RNA样品中是否有基因组DNA污染。RT产物保存-20°C用于PCR检测。
1.2.4 引物设计
引物根据NCBI上鼠的相关mRNA序列设计，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列见下表。
目的基因 Target gene 引物序列 Primer sequence (5’ to 3’)
COD1 F: GCTTCTCGTCTTGCTCTC
R: TCCTGACAACACAACTGG
COD2 F: AGACCTGCCTTACGACTAT
R: AGAGCGACCTGAGTTGTA
GPX1 F: CACCGTGTATGCCTTCTC
R: TTCATTCTTGCCATTCTCCT
catalase F: TCAGGTGCGGACATTCTA
R: ATTGCGTTCTTAGGCTTCT
TLR4 F: TTCACCTCTGCCTTCACT
通过上述公式计算出每一个样本目标基因的表达，通过PPIA校正后相对于对照组的目标基因表达的倍数。
将每个待测样品的cDNA等体积混合，用混合样对反应条件进行优化。其中包括目的基因和内标基因的引物设计和合成、试剂验证、目的基因确认、内标基因有效性验证及最佳退火温度、引物浓度和最佳实验条件评估等。反应体系为 10 μL：2 μL 经 25倍稀释RT 产物（可稀释），上游和下游引物各 0.5μmol/L，12.5 μL 2 × SYBR? Green Real-time PCR Marster Mix，用灭菌三蒸水补足至 25 μL，执行以下PCR反应程序：95°C变性1 min，95°C变性30 sec，64°C退火30 sec，72°C 延伸20 sec，40个循环。
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