miRNA696在骨骼肌纤维形成中的调控机制研究
miRNA696在骨骼肌纤维形成中的调控机制研究[20200510204350]
摘要： 1
摘要：MicroRNAs (miRNA) 是一类长度约为21-25个核苷酸的非编码小分子RNA，其主要参与基因转录后水平的调控。这类小分子RNA主要通过与靶基因mRNA 3’端非编码区的碱基配对来调控靶基因表达。miR-696是一个近期所鉴定的与骨骼肌生长发育相关的miRNA，但其在骨骼肌纤维形成中的作用机制仍不清楚。本研究拟模式动物小鼠为研究材料，采集小鼠不同肌纤维类型的骨骼肌组织，包括心肌、股四头肌（快肌）、趾长伸肌（快肌）、腓肠肌（慢肌）、比目鱼肌（慢肌），并利用Real time PCR技术对miR-696在不同骨骼肌中的表达模式进行检测。研究结果表明，miR-696在不同骨骼肌组织中存在不同的表达模式，在快肌中具有相对较高的表达丰度，这暗示着miR-696可能会抑制快肌的形成。进一步，本研究收集了不同分化阶段的小鼠C2C12细胞，同样利用Real time PCR技术对miR-696在C2C12细胞不同分化阶段的表达模式进行了检测。研究结果显示，随着C2C12分化成肌管的进行，miR-696的表达表现出先下降后上升的趋势，在分化第7天阶段表达水平最高，暗示着miR-696具有促进肌管形成的作用。最后在细胞水平利用脂质体转染试剂将miR-696 mimics转染细胞，并检测了转染mimics后骨骼肌生长发育相关基因的表达变化，遗憾的是所分析的骨骼肌纤维形成相关基因的表达水平并没有发生显著的变化。本研究的开展初步揭示了miR-696与骨骼肌纤维类型形成的关系，为进一步深入研究miR-696与骨骼肌纤维形成的分子调控机制奠定了良好的基础。
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关键字:骨骼肌纤维；miR-696；RealtimePCR技术；microRNAsmimics技术
目录
引言
1 引言
骨骼肌是动物屠宰后形成肉的主要成分，而骨骼肌的主要组成部分是肌纤维，肌纤维类型的差异是影响肌肉品质的重要因素[1]。总体而言，骨骼肌纤维可分为I型纤维（慢收缩型）与II型纤维（快收缩型）两类，而II型纤维又可分为IIA型（快收缩氧化型），IIX型（兼型）和IIB型（快收缩酵解型）三种[2]。当肌肉中快收缩型纤维比例高时，肌肉中的ATPase活性与糖原含量则高，屠宰后肌肉的pH值下降快，容易产生PSE肉[3,4]，并且快收缩型纤维的肌红蛋白和血红蛋白含量低，肌纤维直径粗，因而肌肉显现出苍白色，肉的嫩度也相对较差[5,6]。另外，肌纤维类型与系水力存在密切的联系，快收缩型纤维含量高的肌肉系水力低，并且由于磷脂含量相对较低，肌肉的风味也相对较差[7]。因此，阐明骨骼肌肌纤维形成的分子调控网络，将有助于揭示肌肉品质形成的分子机理，为将来利用分子生物学技术培育高品质新品种产肉动物提供分子理论依据。
microRNA（miRNA）是一类大小在22个核苷酸左右的内源性的非编码单链小RNA分子，成熟的miRNA是由具有发夹结构的约70-90个核苷酸大小的单链RNA前体经过两种RNase III酶Drosha与Dicer加工后生成；miRNAs的调控功能发生在基因转录后调控中，当与靶基因3’非翻译区发生完全性结合时将会对靶基因mRNA进行特异性的降解，当不完全性结合时则会抑制靶基因翻译进程[8]。大量的研究表明，miRNA在细胞增殖、分化、凋亡，生物的生长、发育，以及疾病发生中发挥着重要作用[9,10,11]。而miRNA在骨骼肌的发育过程中的作用也得到了很好的证实，例如，以小鼠为模型，将RNase III酶Dicer在骨骼肌中进行条件性失活之后，骨骼肌肌纤维直径增加，肌纤维数量减少，严重减少了肌肉块量，而骨骼肌纤 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
维的形态也出现了紊乱；相应的是Dicer的缺失导致了许多肌肉特异性miRNAs表达的变化[12]。近年来大量的研究也鉴定出了许多肌肉特异表达的miRNAs，例如miR-1，miR-133，amiR-133b，miR-208，miR-208b，miR-486，miR-49与miR-206等，尽管鉴定出了这么多肌肉特异性表达的miRNAs，但对它们影响肌肉发生发育的具体分子调控机制的研究甚少。
早期的研究表明，过氧化物酶增殖受体γ共活化因子1（peroxisome-proliferator- activated receptor-γ co-activator-1, PGC-1α）是一个与线粒体生物合成与代谢的主要调控因子，其所参与的信号通路多而复杂。早期的研究证明，PGC-1α可诱导许多线粒体基因，如细胞色素氧化酶II与IV基因（COX II与COX IV），以及I型肌纤维特异表达基因，如肌红蛋白（myoglobin）与肌钙蛋白I（troponin I）基因的表达，能有效的将快型肌纤维向慢型肌纤维转换。进一步的研究表明，PGC-1α的这种生理功能需要转录因子MEF2协同作用才能完成，并且上游信号通路中的钙神经素（calcineurin）在其中也发挥着一定的作用[13]。有趣的是，生物信息学显示，PCG-1α是miR-696的靶基因。而在Aoi W等人的研究中发现，小鼠进行4周耐力跑台运动后，腓肠肌中miR-696的表达水平出现了下降，而PGC-1α的蛋白水平却出现了上升；另外，在C2C12细胞中的研究发现，miR-696的短暂升高抑制了PGC-1α的蛋白表达；相反地，用miR-696抑制剂转染C2C12细胞时则会提高PGC-1α蛋白的表达水平[14]。这些研究也暗示着miR-696很有可能通过调控一些骨骼肌特异的靶基因来调控肌纤维类型的特化，但目前对于,miR-696与肌纤维类型的关系仍不清楚。另外，单个miRNA可能存在多个调控的靶基因，目前虽然有研究表明PCG-1α是miR-696的靶基因，但miR-696是否存在其它一些靶基因仍需要作进一步的确定。
对于产肉动物而言，骨骼肌是肉类的主要成份，阐明骨骼肌生长发育中的调控机制，将有利于进一步揭示影响产肉动物产肉量的分子机制。另外，骨骼肌的主要组成部分是肌纤维，肌纤维类型的差异是影响肌肉品质的重要因素，阐明肌纤维类型形成的机制，将有利于揭示肌肉品质形成的分子机制。本研究将从miRNA角度来研究miR-696与骨骼肌纤维类型形成的关系，并初步鉴定其所调控的候选靶基因，本研究的开展可为肌纤维形成的机制提供新的理论依据.。
2 材料与方法
2.1 仪器与试剂
2.1.1 仪器
超净台、CO2细胞培养箱、台式冷冻离心机、超低温冰箱、微型紫外可见分光光度计、-20℃冰箱、普通PCR仪、凝胶成像系统、微波炉、电泳仪、电泳槽、自动双重纯水蒸馏器、制冷器、Real Time PCR Detection System（Applied iosystems 7300 Real Time PCR System）、荧光显微镜。
2.1.2 试剂
胎牛血清、DMEM液体、D-PBS干粉、0.25%trypsin-EDTA溶液、LipofectamineTM2000脂质体转染试剂（Invitrogen公司产 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
品）、Taq DNA聚合酶、dNTP、DL-2000Marker、TRIzol Reagent，M-MLV反转录酶、SYBR Green I real-time PCR Mix。
2.2 方法
2.2 1 小鼠的饲养
按照正常的饲养方式标准饲喂，小鼠饲养在大学动物科技学院动物遗传育种小鼠专用饲养房。小鼠养至体成熟后，采用颈椎脱臼法进行处死，然后采集小鼠不同肌纤维类型的骨骼肌组织，包括心肌、股四头肌（快肌）、趾长伸肌（快肌）、比目鱼肌（慢肌）、腓肠肌（快肌）。
2.2.2 设计miR-696的上游检测引物
从miRBase数据库（）中下载miR-696的成熟序列，根据成熟miR-696的序列设计特异性上游检测引物。
2.2.3 miR-696在不同肌纤维类型的骨骼肌组织中表达模式检测
2.2.3.1 总RNA的提取
利用Life TechnologiesTM 公司的Trizol Reagent试剂盒对不同肌纤维类型的骨骼肌组织（心肌、股四头肌、比目鱼肌、腓肠肌、趾长伸肌）样本进行总RNA的提取，按照该试剂盒的说明书进行操作，具体操作如下：
（1）将-80℃冻存的组织样取出，放入-80℃过夜预冷的研钵中，加入液氮快速充分研磨成粉末状。
（2）待液氮挥化尽后，迅速将磨好的样品转入之前准备好装有Trizol Reagent的10ml离心管中，剧烈振荡几十秒，然后用电动匀浆器匀浆样品1-2min，待组织块细胞充分裂解。（如果同时处理多个样品，可将先裂解的样品放置冰上，等所有样品均裂解完后，再进行下一步的处理；样品按50-100mg加1ml Trizol Reagent，本室验室常按3ml Trizol Reagent的量进行RNA的提取）。
（3）将样品从冰上取出，室温放置5min。
（4）将样品置4℃冷冻离心机，11000-12000rpm离心10min以上，将RNA上清液转入一新的10ml离心管中。
摘要： 1
摘要：MicroRNAs (miRNA) 是一类长度约为21-25个核苷酸的非编码小分子RNA，其主要参与基因转录后水平的调控。这类小分子RNA主要通过与靶基因mRNA 3’端非编码区的碱基配对来调控靶基因表达。miR-696是一个近期所鉴定的与骨骼肌生长发育相关的miRNA，但其在骨骼肌纤维形成中的作用机制仍不清楚。本研究拟模式动物小鼠为研究材料，采集小鼠不同肌纤维类型的骨骼肌组织，包括心肌、股四头肌（快肌）、趾长伸肌（快肌）、腓肠肌（慢肌）、比目鱼肌（慢肌），并利用Real time PCR技术对miR-696在不同骨骼肌中的表达模式进行检测。研究结果表明，miR-696在不同骨骼肌组织中存在不同的表达模式，在快肌中具有相对较高的表达丰度，这暗示着miR-696可能会抑制快肌的形成。进一步，本研究收集了不同分化阶段的小鼠C2C12细胞，同样利用Real time PCR技术对miR-696在C2C12细胞不同分化阶段的表达模式进行了检测。研究结果显示，随着C2C12分化成肌管的进行，miR-696的表达表现出先下降后上升的趋势，在分化第7天阶段表达水平最高，暗示着miR-696具有促进肌管形成的作用。最后在细胞水平利用脂质体转染试剂将miR-696 mimics转染细胞，并检测了转染mimics后骨骼肌生长发育相关基因的表达变化，遗憾的是所分析的骨骼肌纤维形成相关基因的表达水平并没有发生显著的变化。本研究的开展初步揭示了miR-696与骨骼肌纤维类型形成的关系，为进一步深入研究miR-696与骨骼肌纤维形成的分子调控机制奠定了良好的基础。
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1 引言
骨骼肌是动物屠宰后形成肉的主要成分，而骨骼肌的主要组成部分是肌纤维，肌纤维类型的差异是影响肌肉品质的重要因素[1]。总体而言，骨骼肌纤维可分为I型纤维（慢收缩型）与II型纤维（快收缩型）两类，而II型纤维又可分为IIA型（快收缩氧化型），IIX型（兼型）和IIB型（快收缩酵解型）三种[2]。当肌肉中快收缩型纤维比例高时，肌肉中的ATPase活性与糖原含量则高，屠宰后肌肉的pH值下降快，容易产生PSE肉[3,4]，并且快收缩型纤维的肌红蛋白和血红蛋白含量低，肌纤维直径粗，因而肌肉显现出苍白色，肉的嫩度也相对较差[5,6]。另外，肌纤维类型与系水力存在密切的联系，快收缩型纤维含量高的肌肉系水力低，并且由于磷脂含量相对较低，肌肉的风味也相对较差[7]。因此，阐明骨骼肌肌纤维形成的分子调控网络，将有助于揭示肌肉品质形成的分子机理，为将来利用分子生物学技术培育高品质新品种产肉动物提供分子理论依据。
microRNA（miRNA）是一类大小在22个核苷酸左右的内源性的非编码单链小RNA分子，成熟的miRNA是由具有发夹结构的约70-90个核苷酸大小的单链RNA前体经过两种RNase III酶Drosha与Dicer加工后生成；miRNAs的调控功能发生在基因转录后调控中，当与靶基因3’非翻译区发生完全性结合时将会对靶基因mRNA进行特异性的降解，当不完全性结合时则会抑制靶基因翻译进程[8]。大量的研究表明，miRNA在细胞增殖、分化、凋亡，生物的生长、发育，以及疾病发生中发挥着重要作用[9,10,11]。而miRNA在骨骼肌的发育过程中的作用也得到了很好的证实，例如，以小鼠为模型，将RNase III酶Dicer在骨骼肌中进行条件性失活之后，骨骼肌肌纤维直径增加，肌纤维数量减少，严重减少了肌肉块量，而骨骼肌纤 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
维的形态也出现了紊乱；相应的是Dicer的缺失导致了许多肌肉特异性miRNAs表达的变化[12]。近年来大量的研究也鉴定出了许多肌肉特异表达的miRNAs，例如miR-1，miR-133，amiR-133b，miR-208，miR-208b，miR-486，miR-49与miR-206等，尽管鉴定出了这么多肌肉特异性表达的miRNAs，但对它们影响肌肉发生发育的具体分子调控机制的研究甚少。
早期的研究表明，过氧化物酶增殖受体γ共活化因子1（peroxisome-proliferator- activated receptor-γ co-activator-1, PGC-1α）是一个与线粒体生物合成与代谢的主要调控因子，其所参与的信号通路多而复杂。早期的研究证明，PGC-1α可诱导许多线粒体基因，如细胞色素氧化酶II与IV基因（COX II与COX IV），以及I型肌纤维特异表达基因，如肌红蛋白（myoglobin）与肌钙蛋白I（troponin I）基因的表达，能有效的将快型肌纤维向慢型肌纤维转换。进一步的研究表明，PGC-1α的这种生理功能需要转录因子MEF2协同作用才能完成，并且上游信号通路中的钙神经素（calcineurin）在其中也发挥着一定的作用[13]。有趣的是，生物信息学显示，PCG-1α是miR-696的靶基因。而在Aoi W等人的研究中发现，小鼠进行4周耐力跑台运动后，腓肠肌中miR-696的表达水平出现了下降，而PGC-1α的蛋白水平却出现了上升；另外，在C2C12细胞中的研究发现，miR-696的短暂升高抑制了PGC-1α的蛋白表达；相反地，用miR-696抑制剂转染C2C12细胞时则会提高PGC-1α蛋白的表达水平[14]。这些研究也暗示着miR-696很有可能通过调控一些骨骼肌特异的靶基因来调控肌纤维类型的特化，但目前对于,miR-696与肌纤维类型的关系仍不清楚。另外，单个miRNA可能存在多个调控的靶基因，目前虽然有研究表明PCG-1α是miR-696的靶基因，但miR-696是否存在其它一些靶基因仍需要作进一步的确定。
对于产肉动物而言，骨骼肌是肉类的主要成份，阐明骨骼肌生长发育中的调控机制，将有利于进一步揭示影响产肉动物产肉量的分子机制。另外，骨骼肌的主要组成部分是肌纤维，肌纤维类型的差异是影响肌肉品质的重要因素，阐明肌纤维类型形成的机制，将有利于揭示肌肉品质形成的分子机制。本研究将从miRNA角度来研究miR-696与骨骼肌纤维类型形成的关系，并初步鉴定其所调控的候选靶基因，本研究的开展可为肌纤维形成的机制提供新的理论依据.。
2 材料与方法
2.1 仪器与试剂
2.1.1 仪器
超净台、CO2细胞培养箱、台式冷冻离心机、超低温冰箱、微型紫外可见分光光度计、-20℃冰箱、普通PCR仪、凝胶成像系统、微波炉、电泳仪、电泳槽、自动双重纯水蒸馏器、制冷器、Real Time PCR Detection System（Applied iosystems 7300 Real Time PCR System）、荧光显微镜。
2.1.2 试剂
胎牛血清、DMEM液体、D-PBS干粉、0.25%trypsin-EDTA溶液、LipofectamineTM2000脂质体转染试剂（Invitrogen公司产 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
品）、Taq DNA聚合酶、dNTP、DL-2000Marker、TRIzol Reagent，M-MLV反转录酶、SYBR Green I real-time PCR Mix。
2.2 方法
2.2 1 小鼠的饲养
按照正常的饲养方式标准饲喂，小鼠饲养在大学动物科技学院动物遗传育种小鼠专用饲养房。小鼠养至体成熟后，采用颈椎脱臼法进行处死，然后采集小鼠不同肌纤维类型的骨骼肌组织，包括心肌、股四头肌（快肌）、趾长伸肌（快肌）、比目鱼肌（慢肌）、腓肠肌（快肌）。
2.2.2 设计miR-696的上游检测引物
从miRBase数据库（
2.2.3 miR-696在不同肌纤维类型的骨骼肌组织中表达模式检测
2.2.3.1 总RNA的提取
利用Life TechnologiesTM 公司的Trizol Reagent试剂盒对不同肌纤维类型的骨骼肌组织（心肌、股四头肌、比目鱼肌、腓肠肌、趾长伸肌）样本进行总RNA的提取，按照该试剂盒的说明书进行操作，具体操作如下：
（1）将-80℃冻存的组织样取出，放入-80℃过夜预冷的研钵中，加入液氮快速充分研磨成粉末状。
（2）待液氮挥化尽后，迅速将磨好的样品转入之前准备好装有Trizol Reagent的10ml离心管中，剧烈振荡几十秒，然后用电动匀浆器匀浆样品1-2min，待组织块细胞充分裂解。（如果同时处理多个样品，可将先裂解的样品放置冰上，等所有样品均裂解完后，再进行下一步的处理；样品按50-100mg加1ml Trizol Reagent，本室验室常按3ml Trizol Reagent的量进行RNA的提取）。
（3）将样品从冰上取出，室温放置5min。
（4）将样品置4℃冷冻离心机，11000-12000rpm离心10min以上，将RNA上清液转入一新的10ml离心管中。
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