糖尿病型大鼠肠道微生物群落的研究
本实验以大鼠为模型，采用宏基因组16SDNA高通量测序技术研究糖尿病发生对肠道菌群的结构和数量上的影响。实验设置糖尿病造模组和健康对照组，思路是采集糖尿病大鼠的粪便，提取其肠道内的微生物及其基因组DNA, 利用微量分光光度计对基因组DNA精确定量, Miseq测序, 然后去掉两端的引物、嵌合体及靶区域外序列, 进行OTU聚类和物种分类处理。结果发现糖尿病组的丹毒丝菌、拟杆菌、梭菌的数量比健康组高，而变形菌、Negativicutes、双歧杆菌比健康组低。本实验从肠道菌的角度对糖尿病的治疗提供一种思路。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1.材料 1
1.1实验动物 1
1.2仪器 1
1.3主要试剂 2
2.方法 2
2.1糖尿病大鼠的造模 2
2.2 粪便采集 2
2.3收集菌体、提取DNA、测DNA浓度和纯化 2
2.3.1粪便中菌体的收集 2
2.3.2 粪便菌群总DNA的提取 2
2.3.3 大鼠肠道粪便DNA浓度及纯度检测与纯化 2
3.大鼠的肠道菌群宏基因组16sDNA高通量测序 2
4.数据分析与处理 3
4.1分析流程简介 3
4.2分析结果展示 3
4.2.1 数据处理与质控 3
4.2.2样本嵌合体及靶区域外序列的去除 5
4.2.3操作分类单元(OTU)对菌种分类 5
4.2.4赋予物种分类单元 6
5.结果与结论 11
6.讨论 11
致谢 11
参考文献 11
附录 12
糖尿病型大鼠的肠道微生物群落的研究
引言
引言：引发糖尿病的原因包括遗传缺陷、免疫功能紊乱等，有高血糖症状，表现代谢紊乱，会出现多食、多饮、多尿、身体消瘦，即所谓的“三多一少”症状[1]。糖尿病发病后，血糖含量必须得降低，不然一些并发症可能会产生。有眼、肾、心血管和神经疾病
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
等，例如常见的白内障、失明、慢性肾衰竭、动脉粥样化等都与糖尿病有或多或少的关系[2]。
也有人发现，不同的肠道菌群对糖尿病的影响是不一样的[3]。益生菌群、中性菌群和有害菌群，构成了肠道菌群[4]。益生菌因为本身可以合成一些维生素，对宿主的肠道有益，可以阻碍肠道病原菌的生长，乳酸杆菌、双歧杆菌等都属于益生菌类;中性菌群一般是对宿主有益，但如果过度增殖的话，转移不受控制，那么就会对宿主有害，常见的中性菌有大肠杆菌、肠球菌等；最后一类为有害菌，同样有害菌如果增殖不受控的话，将会导致很多疾病，严重的话会致癌。总的来说，益生菌增殖对宿主有益，它能降低糖尿病发病的可能性，起到防护的作用，而有害菌的增殖对宿主有害的。某些有害菌会产生一些毒素，对糖尿病的发生起到诱因的作用[5]。
因肠道微生态系统构成太复杂了，所以国内外对肠道微生物群落的变化与糖尿病的发病的关系研究匮乏。人们的生活水平逐步的提高，伴随而来的是糖尿病的发病率也只高不下，怎么降低糖尿病的发病率，形势将会很严峻。肠道中的某些益生菌可以降低糖尿病的发病，减轻糖尿病的“三多一少”的症状。所以呢，我们就设计了一个实验，用雄性大鼠作为糖尿病模型，来初步研究糖尿病的发生会不会造成肠道某些菌群数量上的改变。
1 材料
1.1 实验动物: 16 只健康雄性大鼠，品系ICR远交系，4周龄
1.2 仪器：离心机，离心管，细菌基因组DNA提取试剂盒，微量分光光度计，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，PCR仪，PCR管、miseq测序平台
1.3 主要试剂：PCR反应所需的Buffer，dNTP ，TaqDNA 聚合酶及 MgCl2，DNA纯化磁珠，磷酸钠Buffer。
以上动物、仪器和试剂均由杭州吉洛生物技术公司提供。
2 方法
2.1 糖尿病大鼠的造模
16 只健康雄性大鼠。随机分为健康对照组与糖尿病造模组，健康组6只，我们给这组大鼠的尾静脉注射柠檬酸钠缓冲液；剩下的10 只大鼠呢，我们还是尾静脉注射，不过是链脲佐菌素（STZ）[6]。胰岛B细胞有降低血糖的作用，而STZ可以选择性地破坏动物的胰岛B细胞，因此这些动物血糖含量就会升高，导致糖尿病。我们注射剂量按120mg/kg，2次，可以隔1周来注射。
糖尿病造模组大鼠第2次注射完成后，我们等一周，然后对两组大鼠分别禁食，时间12h。我们对所有大鼠选取尾部进行采血，测造模组实验大鼠的血糖浓度。我们要挑选造模成功的大鼠。标准是血糖浓度10.8mol/l以上。
2.2 粪便采集
选取血糖浓度10.8mol/l以上的糖尿病造模组大鼠6只进行编号，命名为D1D6，然后我们对每只大鼠进行粪便的采集，包括对照组，各取1g，放置到20℃冰箱。
2.3 收集菌体、提取DNA、测DNA浓度和纯化
2.3.1 粪便中菌体的收集 （1）先把粪便用灭菌的磷酸钠缓冲液进行悬浮，浓度为35ml 0.1mol/L，为了保证粪便样品浑浊均匀无大的残渣，我们要加缓冲液漩涡分别振荡3次，取量10ml，涡漩振荡5min。
（2）2000×g 离心5min，收集上清，弃去沉淀。
（3）重复步骤2洗涤3次。
（4）然后9000×g 离心5min，去掉上清液，收集沉淀（菌体），将上清液转移至一新的离心管。
（5）收集的菌体磷酸钠缓冲液悬浮，缓冲液浓度为35ml 0.1mol/L，振荡同步骤1，然后离心，转速为9000×g，时间5min。
（6）重复步骤5洗涤三次，可收集三次上清液，各收集10ml分装到1.5ml Epp管，每管 1 ml，－70℃冻存。
（7）我们把洗涤好的菌体10ml磷酸钠缓冲液（pH 7.0）中进行悬浮，用移液枪吹打后涡旋振荡混匀，平均分装至12个1.5ml Epp管中，放置20℃冻存，提取DNA时可以直接提取。
目录
2.3.3 大鼠肠道粪便DNA浓度及纯度检测与纯化 DNA浓度及纯度检测：回收得到的DNA片段先用用微量分光光度计测其浓度，然后做琼脂糖凝胶电泳，根据跑胶的条带看DNA的纯度。
测DNA浓度：DNA应在OD260处有显著吸收峰，OD260值为1，相当于大约50 μg/ml双链DNA、40 μg/ml单链DNA。OD260/OD280比值应为1.71.9。
纯化DNA：先用磁珠进行纯化，再对DNA的PCR 产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，然后根据产物片断大小割取相应位置的条带，使用凝胶回收试剂盒提取DNA 溶于ddH2O，并测定样品浓度[11]。
3 大鼠肠道菌群的宏基因组16sDNA高通量测序
高通量测序是一种新兴的测序技术，全基因组重测序、全外显子组测序还有目标区域测序都属于高通量测序的范畴，又称下一代测序技术(nextgeneration sequencing，NGS)。NGS技术在DNA测序方面每一次测量数据通量大、测序时间短、准度也高，样本信息量大[8]。因Sanger第一代测序法得名。3种测序技术分别为Roche/454 焦磷酸测序(2005年)、Illumina/Solexa聚合酶合成测序(2006年)和ABI/Solid 连接酶测序(2007年)技术。Roche/454 焦磷酸测序和Illumina/Solexa聚合酶测序共同的原理是边合成边对样本测序[9]。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1.材料 1
1.1实验动物 1
1.2仪器 1
1.3主要试剂 2
2.方法 2
2.1糖尿病大鼠的造模 2
2.2 粪便采集 2
2.3收集菌体、提取DNA、测DNA浓度和纯化 2
2.3.1粪便中菌体的收集 2
2.3.2 粪便菌群总DNA的提取 2
2.3.3 大鼠肠道粪便DNA浓度及纯度检测与纯化 2
3.大鼠的肠道菌群宏基因组16sDNA高通量测序 2
4.数据分析与处理 3
4.1分析流程简介 3
4.2分析结果展示 3
4.2.1 数据处理与质控 3
4.2.2样本嵌合体及靶区域外序列的去除 5
4.2.3操作分类单元(OTU)对菌种分类 5
4.2.4赋予物种分类单元 6
5.结果与结论 11
6.讨论 11
致谢 11
参考文献 11
附录 12
糖尿病型大鼠的肠道微生物群落的研究
引言
引言：引发糖尿病的原因包括遗传缺陷、免疫功能紊乱等，有高血糖症状，表现代谢紊乱，会出现多食、多饮、多尿、身体消瘦，即所谓的“三多一少”症状[1]。糖尿病发病后，血糖含量必须得降低，不然一些并发症可能会产生。有眼、肾、心血管和神经疾病
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
等，例如常见的白内障、失明、慢性肾衰竭、动脉粥样化等都与糖尿病有或多或少的关系[2]。
也有人发现，不同的肠道菌群对糖尿病的影响是不一样的[3]。益生菌群、中性菌群和有害菌群，构成了肠道菌群[4]。益生菌因为本身可以合成一些维生素，对宿主的肠道有益，可以阻碍肠道病原菌的生长，乳酸杆菌、双歧杆菌等都属于益生菌类;中性菌群一般是对宿主有益，但如果过度增殖的话，转移不受控制，那么就会对宿主有害，常见的中性菌有大肠杆菌、肠球菌等；最后一类为有害菌，同样有害菌如果增殖不受控的话，将会导致很多疾病，严重的话会致癌。总的来说，益生菌增殖对宿主有益，它能降低糖尿病发病的可能性，起到防护的作用，而有害菌的增殖对宿主有害的。某些有害菌会产生一些毒素，对糖尿病的发生起到诱因的作用[5]。
因肠道微生态系统构成太复杂了，所以国内外对肠道微生物群落的变化与糖尿病的发病的关系研究匮乏。人们的生活水平逐步的提高，伴随而来的是糖尿病的发病率也只高不下，怎么降低糖尿病的发病率，形势将会很严峻。肠道中的某些益生菌可以降低糖尿病的发病，减轻糖尿病的“三多一少”的症状。所以呢，我们就设计了一个实验，用雄性大鼠作为糖尿病模型，来初步研究糖尿病的发生会不会造成肠道某些菌群数量上的改变。
1 材料
1.1 实验动物: 16 只健康雄性大鼠，品系ICR远交系，4周龄
1.2 仪器：离心机，离心管，细菌基因组DNA提取试剂盒，微量分光光度计，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，PCR仪，PCR管、miseq测序平台
1.3 主要试剂：PCR反应所需的Buffer，dNTP ，TaqDNA 聚合酶及 MgCl2，DNA纯化磁珠，磷酸钠Buffer。
以上动物、仪器和试剂均由杭州吉洛生物技术公司提供。
2 方法
2.1 糖尿病大鼠的造模
16 只健康雄性大鼠。随机分为健康对照组与糖尿病造模组，健康组6只，我们给这组大鼠的尾静脉注射柠檬酸钠缓冲液；剩下的10 只大鼠呢，我们还是尾静脉注射，不过是链脲佐菌素（STZ）[6]。胰岛B细胞有降低血糖的作用，而STZ可以选择性地破坏动物的胰岛B细胞，因此这些动物血糖含量就会升高，导致糖尿病。我们注射剂量按120mg/kg，2次，可以隔1周来注射。
糖尿病造模组大鼠第2次注射完成后，我们等一周，然后对两组大鼠分别禁食，时间12h。我们对所有大鼠选取尾部进行采血，测造模组实验大鼠的血糖浓度。我们要挑选造模成功的大鼠。标准是血糖浓度10.8mol/l以上。
2.2 粪便采集
选取血糖浓度10.8mol/l以上的糖尿病造模组大鼠6只进行编号，命名为D1D6，然后我们对每只大鼠进行粪便的采集，包括对照组，各取1g，放置到20℃冰箱。
2.3 收集菌体、提取DNA、测DNA浓度和纯化
2.3.1 粪便中菌体的收集 （1）先把粪便用灭菌的磷酸钠缓冲液进行悬浮，浓度为35ml 0.1mol/L，为了保证粪便样品浑浊均匀无大的残渣，我们要加缓冲液漩涡分别振荡3次，取量10ml，涡漩振荡5min。
（2）2000×g 离心5min，收集上清，弃去沉淀。
（3）重复步骤2洗涤3次。
（4）然后9000×g 离心5min，去掉上清液，收集沉淀（菌体），将上清液转移至一新的离心管。
（5）收集的菌体磷酸钠缓冲液悬浮，缓冲液浓度为35ml 0.1mol/L，振荡同步骤1，然后离心，转速为9000×g，时间5min。
（6）重复步骤5洗涤三次，可收集三次上清液，各收集10ml分装到1.5ml Epp管，每管 1 ml，－70℃冻存。
（7）我们把洗涤好的菌体10ml磷酸钠缓冲液（pH 7.0）中进行悬浮，用移液枪吹打后涡旋振荡混匀，平均分装至12个1.5ml Epp管中，放置20℃冻存，提取DNA时可以直接提取。
目录
2.3.3 大鼠肠道粪便DNA浓度及纯度检测与纯化 DNA浓度及纯度检测：回收得到的DNA片段先用用微量分光光度计测其浓度，然后做琼脂糖凝胶电泳，根据跑胶的条带看DNA的纯度。
测DNA浓度：DNA应在OD260处有显著吸收峰，OD260值为1，相当于大约50 μg/ml双链DNA、40 μg/ml单链DNA。OD260/OD280比值应为1.71.9。
纯化DNA：先用磁珠进行纯化，再对DNA的PCR 产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，然后根据产物片断大小割取相应位置的条带，使用凝胶回收试剂盒提取DNA 溶于ddH2O，并测定样品浓度[11]。
3 大鼠肠道菌群的宏基因组16sDNA高通量测序
高通量测序是一种新兴的测序技术，全基因组重测序、全外显子组测序还有目标区域测序都属于高通量测序的范畴，又称下一代测序技术(nextgeneration sequencing，NGS)。NGS技术在DNA测序方面每一次测量数据通量大、测序时间短、准度也高，样本信息量大[8]。因Sanger第一代测序法得名。3种测序技术分别为Roche/454 焦磷酸测序(2005年)、Illumina/Solexa聚合酶合成测序(2006年)和ABI/Solid 连接酶测序(2007年)技术。Roche/454 焦磷酸测序和Illumina/Solexa聚合酶测序共同的原理是边合成边对样本测序[9]。
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