几种临床分离禽大肠杆菌的药物敏感性研究
几种临床分离禽大肠杆菌的药物敏感性研究[20200507190651]
摘要：为研究匹美西林与其他抗菌药物对临床分离禽大肠杆菌的体外配伍应用效果，本试验采用微量稀释法测定了临床常用抗菌药物对几种临床分离禽大肠杆菌的最低抑菌浓度（MIC）；采用微量稀释棋盘法，测定匹美西林与其他抗菌药物联合应用对几种大肠杆菌的联合抗菌指数（FIC）。结果表明：匹美西林对禽大肠杆菌的MIC为2～4 μg/ mL；棋盘法测得匹美西林与磷霉素钙、舒巴坦钠、单硫酸卡那霉素联用对临床分离禽大肠杆菌呈协同或相加作用，部分呈无关作用，联合用药具有一定价值。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:大肠杆菌；MIC；联合药敏试验；FIC
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法1
1.1供试药品 1
1.2培养基和试剂 2
1.3试验菌株2
1.4仪器设备2
1.5试验方法2
1.5.1药物原液配制 2
1.5.2 菌液制备2
1.5.3 单药MIC测定2
1.5.4 联合药敏FIC指数测定2
1.6结果判定标准 3
1.6.1 MIC结果判定 3
1.6.2 FIC结果判定 3
2 结果3
2.1单一药物最小抑菌浓度(MIC)的测定结果3
2.2 联合药敏试验结果 4
3讨论与分析4
3.1 常用抗菌药对临床分离禽大肠杆菌的抗菌活性 4
3.2 匹美西林与其他抗菌药联合效果 5
致谢5
参考文献6
几种临床分离禽大肠杆菌的药物敏感性研究
引言
大肠杆菌病是禽常见多发病，对养殖业危害较大。大肠杆菌临床用药繁多，而且由于抗菌药物长期大量使用和滥用，导致细菌发生变异的耐药菌株不断增加，并使临床效果越来越不明显，给治疗带来了困难[1]。因此合理的联合用药对治疗大肠杆菌病至关重要，而安全有效的使用抗生素, 必须通过药敏试验来进行筛选和确定剂量，有选择性地用药。因此, 为了临床选择有效的抗菌药物组合进行治疗提供实验依据或减少药物的浪费, 有必要在体外预先进行药物敏感试验[2]。本试验采用匹美西林以及其他多种常用抗菌药物对几种临床分离禽大肠杆 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
菌进行体外药敏试验，分别测出各抗菌药的MIC（最低抑菌浓度），再采用微量棋盘法进行联合药敏试验，测出其联合抗菌指数（FIC），旨在探讨匹美西林与其他抗菌药联合应用对禽大肠杆菌的体外抑菌效果，以期对临床上合理的抗菌药联合应用提供试验数据，从而为临床治疗禽耐药大肠杆菌病提供有效的联合用药方案。
1 材料与方法
1.1 供试药品
匹美西林(95.0%)、阿莫西林（100.1%）、氟苯尼考(99.3%)、痢菌净(99.0%)、乳酸甲氧苄氨嘧啶(98.9%)、磺胺间甲氧嘧啶（98.6%）、酒石酸泰乐菌素（99.3%）、单硫酸卡那霉素(77.1%)、硫酸新霉素（98.5%）、盐酸多西环素(89.5%)、硫酸粘菌素(23619IU/mg)、舒巴坦钠(90.6%)、盐酸环丙沙星（99.4%）、头孢噻呋钠（98.9%）、林可霉素（98.5%）、磷霉素钙（99.3%）。
1.2 培养基和试剂
LB肉汤：上海盛思生化科技有限公司，批号130801；
MH肉汤：上海盛思生化科技有限公司，批号130101；
LB琼脂：上海盛思生化科技有限公司，批号130901；
试剂：二甲基甲酰胺、磷酸、碳酸钠等。
1.3 试验菌株
临床分离禽大肠杆菌115、大肠杆菌116、大肠杆菌117、大肠杆菌102、大肠杆菌204：大学动物医学院药理组保存。
1.4 仪器设备
立式压力蒸汽灭菌器：型号LB-B5OL，上海华线医用核子仪器有限公司；
数显鼓风干燥箱：型号GZX-9240 MBE，上海博迅实业有限公司医疗设备；
洁净工作台：型号SW-CJ-1F，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；
电子分析天平：型号BSA224S，赛多利斯科科学仪器（北京）有限公司；
隔水式恒温培养箱：型号GRP-9160，上海森信试验仪器有限公司。
1.5 试验方法
1.5.1 药物原液的配制
用电子天平称取各种药物，将药物用蒸馏水溶解，用0.22 μm滤膜于超净台中过滤除菌，配制成100 mL的2560 μg/ mL储备原液。原液置4 ℃冰箱中保存备用，各贮存液在一周内用完。其中匹美西林难溶于水，加入80 μL磷酸助溶；氟苯尼考用二甲基甲酰胺滴加振摇至完全溶解，以蒸馏水定容至100 mL；阿莫西林难溶于水，加入约80 mg碳酸钠助溶。
1.5.2 菌液制备
本试验所用细菌为实验室保存的临床分离禽大肠杆菌，先将菌种接种在普通LB肉汤培养基中，使其活化，然后将细菌接种于LB琼脂平板中，在37 ℃培养箱中过夜培养。挑取单个菌落接种于LB肉汤中，37 ℃培养箱中培养10 h，使菌悬液浓度相当于109 CFU /mL。菌液在使用前用MH肉汤稀释100倍，培养2～4 h，再用MH肉汤稀释1000倍，使试验时菌悬液浓度约为105 CFU /mL[3]。
1.5.3 单药MIC测定
微量稀释法：本次试验共16种抗菌药，取灭菌的96孔微型反应板，A-H 八排，每排测1种药物对1株菌的最低抑菌浓度（MIC），每种药物做3个重复试验。整个试验在超净工作台中进行，试验中96孔板第1孔加入18 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
0 μL 制备好的菌液，第2～10孔加100 μL 菌液，第1孔中加入药物原液20 μL，则第1孔药物稀释了10倍，浓度为256 μg/ mL，从第1孔中取100 μL液体加入第2孔，依次倍比稀释至第10孔，第10孔吸取100 μL液体弃掉。第11孔加入100 μL菌液，作为阳性对照，第12孔只加入100 μL MH肉汤，作为阴性对照。将96孔板置于37 ℃ 恒温培养箱内培养16～20 h 后在有黑色背景的光源下观察, 有菌生长的底部呈扣状沉淀,无菌生长孔所含的最低药物浓度即为MIC。
1.5.4 联合药敏FIC指数测定
肉汤稀释棋盘法：以单药最低抑菌浓度( MIC)试验结果为依据, 肉汤稀释棋盘法设计两药的4 倍、2 倍、1 倍、1/ 2 倍、1 / 4 倍、1/ 8 倍MIC 进行6 × 6 联合[4]。将匹美西林与其他药物原液分别用MH肉汤稀释至所需浓度，选取96 孔板A-H 排的1~7 孔作为试验区域，将匹美西林的6个浓度由高至低以纵列方式分别从第1纵列至第6纵列加入, 每孔50 μL，第7纵列作为其他药物的单药对照。其他药物的6个浓度由高至低以横排方式分别从A排至F排加入, 每孔50 μL,G排作为匹美西林的单药对照。匹美西林和其他药物的单药对照孔中分别加相对应浓度的药液100 μL，然后各孔加入100 μL 上述制备的菌悬液,第8纵列每孔加200 μL 菌液, 作为阳性生长对照。第9纵列每孔加入200 μL MH肉汤作为阴性对照。将96孔板放于37 ℃恒温培养箱, 18 h后观察并记录结果。
乳酸TMP 1.25 / 1.25 / /
舒巴坦钠 0.625 0.75 1 1 1.5
氟苯尼考 1.25 2 2 3 3
单硫酸卡那霉素 1.5 1 1 2 0.75
痢菌净 1 1.5 0.75 1.5 2
阿莫西林 / / 1.5 / /
磺胺间甲氧嘧啶 / / / / 1.25
注：表中“/”表示该种抗菌药在测定最低抑菌浓度（MIC）时， MIC值大于本次试验最高药物浓度256μg/ mL，细菌对其产生严重耐药性，故并未进行其联合药敏试验。
摘要：为研究匹美西林与其他抗菌药物对临床分离禽大肠杆菌的体外配伍应用效果，本试验采用微量稀释法测定了临床常用抗菌药物对几种临床分离禽大肠杆菌的最低抑菌浓度（MIC）；采用微量稀释棋盘法，测定匹美西林与其他抗菌药物联合应用对几种大肠杆菌的联合抗菌指数（FIC）。结果表明：匹美西林对禽大肠杆菌的MIC为2～4 μg/ mL；棋盘法测得匹美西林与磷霉素钙、舒巴坦钠、单硫酸卡那霉素联用对临床分离禽大肠杆菌呈协同或相加作用，部分呈无关作用，联合用药具有一定价值。
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关键字:大肠杆菌；MIC；联合药敏试验；FIC
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法1
1.1供试药品 1
1.2培养基和试剂 2
1.3试验菌株2
1.4仪器设备2
1.5试验方法2
1.5.1药物原液配制 2
1.5.2 菌液制备2
1.5.3 单药MIC测定2
1.5.4 联合药敏FIC指数测定2
1.6结果判定标准 3
1.6.1 MIC结果判定 3
1.6.2 FIC结果判定 3
2 结果3
2.1单一药物最小抑菌浓度(MIC)的测定结果3
2.2 联合药敏试验结果 4
3讨论与分析4
3.1 常用抗菌药对临床分离禽大肠杆菌的抗菌活性 4
3.2 匹美西林与其他抗菌药联合效果 5
致谢5
参考文献6
几种临床分离禽大肠杆菌的药物敏感性研究
引言
大肠杆菌病是禽常见多发病，对养殖业危害较大。大肠杆菌临床用药繁多，而且由于抗菌药物长期大量使用和滥用，导致细菌发生变异的耐药菌株不断增加，并使临床效果越来越不明显，给治疗带来了困难[1]。因此合理的联合用药对治疗大肠杆菌病至关重要，而安全有效的使用抗生素, 必须通过药敏试验来进行筛选和确定剂量，有选择性地用药。因此, 为了临床选择有效的抗菌药物组合进行治疗提供实验依据或减少药物的浪费, 有必要在体外预先进行药物敏感试验[2]。本试验采用匹美西林以及其他多种常用抗菌药物对几种临床分离禽大肠杆 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
菌进行体外药敏试验，分别测出各抗菌药的MIC（最低抑菌浓度），再采用微量棋盘法进行联合药敏试验，测出其联合抗菌指数（FIC），旨在探讨匹美西林与其他抗菌药联合应用对禽大肠杆菌的体外抑菌效果，以期对临床上合理的抗菌药联合应用提供试验数据，从而为临床治疗禽耐药大肠杆菌病提供有效的联合用药方案。
1 材料与方法
1.1 供试药品
匹美西林(95.0%)、阿莫西林（100.1%）、氟苯尼考(99.3%)、痢菌净(99.0%)、乳酸甲氧苄氨嘧啶(98.9%)、磺胺间甲氧嘧啶（98.6%）、酒石酸泰乐菌素（99.3%）、单硫酸卡那霉素(77.1%)、硫酸新霉素（98.5%）、盐酸多西环素(89.5%)、硫酸粘菌素(23619IU/mg)、舒巴坦钠(90.6%)、盐酸环丙沙星（99.4%）、头孢噻呋钠（98.9%）、林可霉素（98.5%）、磷霉素钙（99.3%）。
1.2 培养基和试剂
LB肉汤：上海盛思生化科技有限公司，批号130801；
MH肉汤：上海盛思生化科技有限公司，批号130101；
LB琼脂：上海盛思生化科技有限公司，批号130901；
试剂：二甲基甲酰胺、磷酸、碳酸钠等。
1.3 试验菌株
临床分离禽大肠杆菌115、大肠杆菌116、大肠杆菌117、大肠杆菌102、大肠杆菌204：大学动物医学院药理组保存。
1.4 仪器设备
立式压力蒸汽灭菌器：型号LB-B5OL，上海华线医用核子仪器有限公司；
数显鼓风干燥箱：型号GZX-9240 MBE，上海博迅实业有限公司医疗设备；
洁净工作台：型号SW-CJ-1F，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；
电子分析天平：型号BSA224S，赛多利斯科科学仪器（北京）有限公司；
隔水式恒温培养箱：型号GRP-9160，上海森信试验仪器有限公司。
1.5 试验方法
1.5.1 药物原液的配制
用电子天平称取各种药物，将药物用蒸馏水溶解，用0.22 μm滤膜于超净台中过滤除菌，配制成100 mL的2560 μg/ mL储备原液。原液置4 ℃冰箱中保存备用，各贮存液在一周内用完。其中匹美西林难溶于水，加入80 μL磷酸助溶；氟苯尼考用二甲基甲酰胺滴加振摇至完全溶解，以蒸馏水定容至100 mL；阿莫西林难溶于水，加入约80 mg碳酸钠助溶。
1.5.2 菌液制备
本试验所用细菌为实验室保存的临床分离禽大肠杆菌，先将菌种接种在普通LB肉汤培养基中，使其活化，然后将细菌接种于LB琼脂平板中，在37 ℃培养箱中过夜培养。挑取单个菌落接种于LB肉汤中，37 ℃培养箱中培养10 h，使菌悬液浓度相当于109 CFU /mL。菌液在使用前用MH肉汤稀释100倍，培养2～4 h，再用MH肉汤稀释1000倍，使试验时菌悬液浓度约为105 CFU /mL[3]。
1.5.3 单药MIC测定
微量稀释法：本次试验共16种抗菌药，取灭菌的96孔微型反应板，A-H 八排，每排测1种药物对1株菌的最低抑菌浓度（MIC），每种药物做3个重复试验。整个试验在超净工作台中进行，试验中96孔板第1孔加入18 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
0 μL 制备好的菌液，第2～10孔加100 μL 菌液，第1孔中加入药物原液20 μL，则第1孔药物稀释了10倍，浓度为256 μg/ mL，从第1孔中取100 μL液体加入第2孔，依次倍比稀释至第10孔，第10孔吸取100 μL液体弃掉。第11孔加入100 μL菌液，作为阳性对照，第12孔只加入100 μL MH肉汤，作为阴性对照。将96孔板置于37 ℃ 恒温培养箱内培养16～20 h 后在有黑色背景的光源下观察, 有菌生长的底部呈扣状沉淀,无菌生长孔所含的最低药物浓度即为MIC。
1.5.4 联合药敏FIC指数测定
肉汤稀释棋盘法：以单药最低抑菌浓度( MIC)试验结果为依据, 肉汤稀释棋盘法设计两药的4 倍、2 倍、1 倍、1/ 2 倍、1 / 4 倍、1/ 8 倍MIC 进行6 × 6 联合[4]。将匹美西林与其他药物原液分别用MH肉汤稀释至所需浓度，选取96 孔板A-H 排的1~7 孔作为试验区域，将匹美西林的6个浓度由高至低以纵列方式分别从第1纵列至第6纵列加入, 每孔50 μL，第7纵列作为其他药物的单药对照。其他药物的6个浓度由高至低以横排方式分别从A排至F排加入, 每孔50 μL,G排作为匹美西林的单药对照。匹美西林和其他药物的单药对照孔中分别加相对应浓度的药液100 μL，然后各孔加入100 μL 上述制备的菌悬液,第8纵列每孔加200 μL 菌液, 作为阳性生长对照。第9纵列每孔加入200 μL MH肉汤作为阴性对照。将96孔板放于37 ℃恒温培养箱, 18 h后观察并记录结果。
乳酸TMP 1.25 / 1.25 / /
舒巴坦钠 0.625 0.75 1 1 1.5
氟苯尼考 1.25 2 2 3 3
单硫酸卡那霉素 1.5 1 1 2 0.75
痢菌净 1 1.5 0.75 1.5 2
阿莫西林 / / 1.5 / /
磺胺间甲氧嘧啶 / / / / 1.25
注：表中“/”表示该种抗菌药在测定最低抑菌浓度（MIC）时， MIC值大于本次试验最高药物浓度256μg/ mL，细菌对其产生严重耐药性，故并未进行其联合药敏试验。
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