猪去脂胚胎的冷冻及优化
猪卵母细胞及其早期胚胎含有较多的脂滴，许多研究证实了猪卵母细胞与胚胎对低温的敏感与其高脂肪含量相关。当温度低于0℃时，大量的脂肪滴溢出，膜破裂，细胞崩解，同时，由于脂滴含量的变化，不同发育阶段猪胚胎冷冻保存的敏感性不同，发育阶段越早，其冷冻耐受力越低。所以去脂可使猪胚胎获得对冷冻的耐受力。另一方面，冷冻方法也显著影响着猪胚胎冷冻保存的效果。由于猪胚胎冷冻效率较低且不稳定，冷冻保存难度大，而低效率保存技术不仅会降低猪的遗传多样性，而且在一定程度上阻碍了繁殖技术的应用。好的冷冻方法可以提高冷冻的速度,进而减少冷冻保护剂的浓度,提高胚胎的冷冻复苏效率。所以本试验希望基于去脂与冷冻结合，进而优化猪胚胎的冷冻技术。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1 材料与方法4
1.1 材料4
1.1.1 实验动物4
1.1.2 主要实验试4
1.2 方法4
1.2.1 卵巢和卵母细胞的采集4
1.2.2 卵母细胞的体外成熟5
1.2.3 卵母细胞离心去脂5
1.2.4 卵母细胞孤雌激活5
1.2.5 冷冻和复苏5
1.2.6 胚胎发育观察并确定体外发育胚胎最佳冷冻时间5
1.2.7 离心去脂对照实验6
2 结果与分析6
3 讨论 7
4 结论8
致谢8
参考文献9
表1 实验记录表6
图2 孤雌激活后第六日（D6）胚胎解冻后复苏7
猪去脂胚胎的冷冻及优化
引言
引言: 猪胚胎冷冻保存的原因有两个。首先，许多国家为了提高猪的生产率和瘦肉率，没有得当保护家猪的品种，而使其陷入危险之中。虽然精液保存方法已经建立但是通过人工受精的方法恢复一个品种的过程是漫长和昂贵的。所以对猪胚胎进行冷冻保存是一个更有效和更经济的保护生物多样性的方式。猪胚胎保存对增加高质量遗传资源的高效利用，阻止疾病通过动物传播以及降低猪的运输成 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
本具有重要意义[1 ,3]
其次，由于世界范围的竞争，生猪养殖企业需要进行生猪的运送。然而这个运输成本非常昂贵，运送新鲜胚胎的存储时间仅限于24小时之内，且对动物和人的健康都存在危害，并且不是一种福利的行为。但猪胚胎中含有大量的脂肪颗粒，导致猪胚胎对低温非常敏感，常温下，脂肪滴均匀分散分布于猪卵子和胚胎中，其空间结构在45℃时发生相互聚集的趋势。低于0℃时大量脂肪滴溢出，膜破裂，细胞崩解[2]。猪胚胎的冷冻保存较其他哺乳动物难度更大，所以直到上个世纪，猪胚胎超低温保存才开始得到应用，最早的冷冻是在冷冻保护剂中进行缓慢降温，由于这种传统的慢速冷冻程序不能为猪胚胎的冷冻保存提供令人满意的结果，所以一种快速的冷却技术玻璃化冷冻技术取得迅速的进展[3]。
孤雌激活胚胎是一个特殊的生物现象，卵母细胞的一个简单的化学或物理刺激可以让它穿过一个植入前发育，反映出了正常情况下的形态（后来形成的一个完整的胚胎盘）和功能（延长受体动物转移后的发情周期）。在孤雌激活胚胎的众多用途中，最重要的是在基于胚胎冷冻的孤雌激活，因为这能使猪胚胎得到高发育率。然而，猪胚胎的冷冻保存仍是一项挑战，而且即使玻璃化冷冻在体外和体内生产的猪胚胎已存在成功的案例，在体外生产出的胚胎的低温耐受性仍较体内源性胚胎更低。猪孤雌激活胚胎在脱脂后具有较高的低温耐受性，但脂肪含量是重要的能源和胚胎早期发育合成的资源，所以脱脂和抑制脂质代谢会降低质量和胚胎的发育。[4]
有几个因素是猪胚胎进行冷冻的关键。第一是玻璃化冷冻的时间。猪体内胚胎冷冻保存之后的灵敏度取决于他们的年龄，正如前文所说的发育阶段决定冷冻耐受力。另一个因素是通过判断复苏之后的胚胎的用途从而选择使用的方法。冷冻速率也是胚胎玻璃化冷冻中一个关键因素。冷冻速率的增加可以减少冷冻损伤[5,6]并且可以允许冷冻保护剂浓度的减少[7]。
因此本研究以体外成熟卵子经孤雌激活所获胚胎为研究模型，试图在现有Cryotop的玻璃化冷冻技术的基础上，通过统计离心去脂胚胎不同发育阶段进行的冷冻效果，优化Cryotop玻璃化冷冻体系，以期确定猪孤雌激活胚胎的玻璃化冷冻的最佳时间或阶段，从而提高猪胚胎冷冻成功率,，为猪胚胎的冷冻保存提供借鉴。
1 材料与方法
1.1实验材料
1.1.1实验动物
卵巢从屠宰场采取，保存在37℃，加有青链霉素生理盐水的保温瓶中，四小时内运回实验室。
1.1.2主要实验试剂
T2：TCM199中添加2%的牛血清（cow serum），4℃保存。
T20：TCM199中添加20%的牛血清（cow serum），4℃保存。
HYA：透明质酸酶，溶解于TCM199中，1.0mg/ml，0.22um滤器过滤，20℃冷冻保存。
PCC：由PZM3、放线菌酮(CHX)、细胞松弛素(CB)按体积比1000：10：1配制，用于化学激活。
洗 液(WS)：TCM199+20%血清(Serum)
平衡液(ES)：10%乙二醇(EG)+10%二甲基亚砜(DMSO)+TCM199+20%牛血清(CS)
冷冻液(VS)：18% EG+18% DMSO+0.5M蔗糖(suc)+TCM199+20%CS
解冻液(TS)：1.0 M suc+M199+20%CS
缓冲液(DS)：0.5 M suc +M199 + 20%CS
洗 液(Ws1,Ws2)：M199+20%CS
1.2实验方法
1.2.1卵巢和卵母细胞的采集
从屠宰场采取卵巢，保温于37℃含双抗(青链霉素)的高压灭菌后的生理盐水中，尽快运回实验室。在无菌室中用—次性18号针头的20ml注射器吸取36mm的透明卵泡的卵泡液，放入高压灭菌后的15ml大离心管中，在38.5℃下静止，15min后用—次性吸管吸走沉淀后的上层液体，加入适量洗卵液，于直径为60mm的—次性培养皿中，用拉制好的直径2.5mm的玻璃针在体视显微镜下捡出致密且带有35层卵丘细胞的卵母细胞。
1.2.2卵母细胞的体外成熟
用平衡了两小时以上的洗卵液清洗干净后，再用平衡了两小时以上的IVM液洗三次，然后移入平衡4小时的每孔400ul的IVM液（覆盖400ul无菌石蜡油）的四孔板中，于38.5℃，5%CO2，饱和湿度的培养箱中培养4244h。
1.2.3卵母细胞离心去脂
在卵母细胞成熟后，将它们随机平均分成两组：去脂组/非去脂组。去脂组选取成熟培养42h的卵丘卵母细胞，将其移入预热为38.5℃含500ul0.1%透明质酸酶1.5ml管中，用100ul移液枪轻轻吹打100次去除卵丘细胞，并且在T20中洗3次，每次15秒。再移入含300μl 7.5μg/ml CB的1.5ml管中室温离心20分钟，转速为12000转/分钟。离心后在已平衡4h的IVM培养液中平衡1小时，在T2中洗三次后，在3.3mg/ml的链酶蛋白酶中去掉透明带（防止后面培养中脂滴重新融入卵母细胞），在T2、T20、T2中各洗一次。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1 材料与方法4
1.1 材料4
1.1.1 实验动物4
1.1.2 主要实验试4
1.2 方法4
1.2.1 卵巢和卵母细胞的采集4
1.2.2 卵母细胞的体外成熟5
1.2.3 卵母细胞离心去脂5
1.2.4 卵母细胞孤雌激活5
1.2.5 冷冻和复苏5
1.2.6 胚胎发育观察并确定体外发育胚胎最佳冷冻时间5
1.2.7 离心去脂对照实验6
2 结果与分析6
3 讨论 7
4 结论8
致谢8
参考文献9
表1 实验记录表6
图2 孤雌激活后第六日（D6）胚胎解冻后复苏7
猪去脂胚胎的冷冻及优化
引言
引言: 猪胚胎冷冻保存的原因有两个。首先，许多国家为了提高猪的生产率和瘦肉率，没有得当保护家猪的品种，而使其陷入危险之中。虽然精液保存方法已经建立但是通过人工受精的方法恢复一个品种的过程是漫长和昂贵的。所以对猪胚胎进行冷冻保存是一个更有效和更经济的保护生物多样性的方式。猪胚胎保存对增加高质量遗传资源的高效利用，阻止疾病通过动物传播以及降低猪的运输成 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
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其次，由于世界范围的竞争，生猪养殖企业需要进行生猪的运送。然而这个运输成本非常昂贵，运送新鲜胚胎的存储时间仅限于24小时之内，且对动物和人的健康都存在危害，并且不是一种福利的行为。但猪胚胎中含有大量的脂肪颗粒，导致猪胚胎对低温非常敏感，常温下，脂肪滴均匀分散分布于猪卵子和胚胎中，其空间结构在45℃时发生相互聚集的趋势。低于0℃时大量脂肪滴溢出，膜破裂，细胞崩解[2]。猪胚胎的冷冻保存较其他哺乳动物难度更大，所以直到上个世纪，猪胚胎超低温保存才开始得到应用，最早的冷冻是在冷冻保护剂中进行缓慢降温，由于这种传统的慢速冷冻程序不能为猪胚胎的冷冻保存提供令人满意的结果，所以一种快速的冷却技术玻璃化冷冻技术取得迅速的进展[3]。
孤雌激活胚胎是一个特殊的生物现象，卵母细胞的一个简单的化学或物理刺激可以让它穿过一个植入前发育，反映出了正常情况下的形态（后来形成的一个完整的胚胎盘）和功能（延长受体动物转移后的发情周期）。在孤雌激活胚胎的众多用途中，最重要的是在基于胚胎冷冻的孤雌激活，因为这能使猪胚胎得到高发育率。然而，猪胚胎的冷冻保存仍是一项挑战，而且即使玻璃化冷冻在体外和体内生产的猪胚胎已存在成功的案例，在体外生产出的胚胎的低温耐受性仍较体内源性胚胎更低。猪孤雌激活胚胎在脱脂后具有较高的低温耐受性，但脂肪含量是重要的能源和胚胎早期发育合成的资源，所以脱脂和抑制脂质代谢会降低质量和胚胎的发育。[4]
有几个因素是猪胚胎进行冷冻的关键。第一是玻璃化冷冻的时间。猪体内胚胎冷冻保存之后的灵敏度取决于他们的年龄，正如前文所说的发育阶段决定冷冻耐受力。另一个因素是通过判断复苏之后的胚胎的用途从而选择使用的方法。冷冻速率也是胚胎玻璃化冷冻中一个关键因素。冷冻速率的增加可以减少冷冻损伤[5,6]并且可以允许冷冻保护剂浓度的减少[7]。
因此本研究以体外成熟卵子经孤雌激活所获胚胎为研究模型，试图在现有Cryotop的玻璃化冷冻技术的基础上，通过统计离心去脂胚胎不同发育阶段进行的冷冻效果，优化Cryotop玻璃化冷冻体系，以期确定猪孤雌激活胚胎的玻璃化冷冻的最佳时间或阶段，从而提高猪胚胎冷冻成功率,，为猪胚胎的冷冻保存提供借鉴。
1 材料与方法
1.1实验材料
1.1.1实验动物
卵巢从屠宰场采取，保存在37℃，加有青链霉素生理盐水的保温瓶中，四小时内运回实验室。
1.1.2主要实验试剂
T2：TCM199中添加2%的牛血清（cow serum），4℃保存。
T20：TCM199中添加20%的牛血清（cow serum），4℃保存。
HYA：透明质酸酶，溶解于TCM199中，1.0mg/ml，0.22um滤器过滤，20℃冷冻保存。
PCC：由PZM3、放线菌酮(CHX)、细胞松弛素(CB)按体积比1000：10：1配制，用于化学激活。
洗 液(WS)：TCM199+20%血清(Serum)
平衡液(ES)：10%乙二醇(EG)+10%二甲基亚砜(DMSO)+TCM199+20%牛血清(CS)
冷冻液(VS)：18% EG+18% DMSO+0.5M蔗糖(suc)+TCM199+20%CS
解冻液(TS)：1.0 M suc+M199+20%CS
缓冲液(DS)：0.5 M suc +M199 + 20%CS
洗 液(Ws1,Ws2)：M199+20%CS
1.2实验方法
1.2.1卵巢和卵母细胞的采集
从屠宰场采取卵巢，保温于37℃含双抗(青链霉素)的高压灭菌后的生理盐水中，尽快运回实验室。在无菌室中用—次性18号针头的20ml注射器吸取36mm的透明卵泡的卵泡液，放入高压灭菌后的15ml大离心管中，在38.5℃下静止，15min后用—次性吸管吸走沉淀后的上层液体，加入适量洗卵液，于直径为60mm的—次性培养皿中，用拉制好的直径2.5mm的玻璃针在体视显微镜下捡出致密且带有35层卵丘细胞的卵母细胞。
1.2.2卵母细胞的体外成熟
用平衡了两小时以上的洗卵液清洗干净后，再用平衡了两小时以上的IVM液洗三次，然后移入平衡4小时的每孔400ul的IVM液（覆盖400ul无菌石蜡油）的四孔板中，于38.5℃，5%CO2，饱和湿度的培养箱中培养4244h。
1.2.3卵母细胞离心去脂
在卵母细胞成熟后，将它们随机平均分成两组：去脂组/非去脂组。去脂组选取成熟培养42h的卵丘卵母细胞，将其移入预热为38.5℃含500ul0.1%透明质酸酶1.5ml管中，用100ul移液枪轻轻吹打100次去除卵丘细胞，并且在T20中洗3次，每次15秒。再移入含300μl 7.5μg/ml CB的1.5ml管中室温离心20分钟，转速为12000转/分钟。离心后在已平衡4h的IVM培养液中平衡1小时，在T2中洗三次后，在3.3mg/ml的链酶蛋白酶中去掉透明带（防止后面培养中脂滴重新融入卵母细胞），在T2、T20、T2中各洗一次。
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