超声波法提取凹叶厚朴内生真菌代谢产物(附件)
摘 要凹叶厚朴作为濒危药用植物，含有天然的化学成分厚朴酚及和厚朴酚，有很多复方制剂中用到凹叶厚朴的有效成分，但药用植物厚朴的资源接近于匮乏，为保护中药资源，迫切需要寻找新的解决办法。内生真菌代谢产物产生与宿主相同或相似的成分，从内生真菌发酵液中提取代谢产物代替原植物中的有效成分，而传统方法提取内生真菌代谢产物效率低，影响内生真菌的开发与利用，已经不能满足当前现状，为提高中药资源凹叶厚朴的利用率，本文对凹叶厚朴内生真菌做了如下研究：采用超声波提取技术优化内生真菌发酵液提取条件。设计单因素试验，考察各种单因素实验对提取效果的影响。采用正交试验设计，得到最佳超声提取条件。结果表明：超声提取凹叶厚朴内生真菌代谢产物最佳的工艺条件为：超声处理功率为100%，超声处理时间为60 min，超声温度为50℃。其中三个因素中影响内生真菌代谢产物提取率的主次为：超声功率>超声时间>超声温度。经研究得出，本实验方法能够用于内生真菌发酵液中代谢产物提取。目 录
1 文献综述
1.1 凹叶厚朴简介 1
1.2 植物内生真菌的研究 1
1.2.1 内生真菌的多样性 1
1.2.2 内生真菌代谢产物 2
1.3 超声波技术 2
1.3.1 超声波萃取技术在天然产物上的应用 3
1.3.2 超声波萃取技术在生物发酵工程中的应用 3
1.4 厚朴内生真菌代谢产物提取的研究 3
2 实验部分
2.1 实验材料 5
2.1.1 菌种来源 5
2.1.2 仪器 5
2.1.3 药品试剂 5
2.1.4 培养基的配制 5
2.2 实验方法 6
2.2.1 菌种复壮 6
2.2.2 液体发酵培养 6
2.2.3 发酵液的提取 6
2.2.4 菌丝体的提取 6
2.2.5 单因素试验设计 6
2.2.6 正交试验设计 7
2.3 凹叶厚朴内生真菌代谢产物厚朴酚的含量测定 7
2.3.1 仪器、药品与试剂 7
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
> 2.2.1 菌种复壮 6
2.2.2 液体发酵培养 6
2.2.3 发酵液的提取 6
2.2.4 菌丝体的提取 6
2.2.5 单因素试验设计 6
2.2.6 正交试验设计 7
2.3 凹叶厚朴内生真菌代谢产物厚朴酚的含量测定 7
2.3.1 仪器、药品与试剂 7
2.3.2 对照品溶液制备 7
2.3.3 供试品溶液的制备 7
2.3.4 色谱条件与系统适用性试验 8
2.3.5 线性关系考察 8
2.4 结果与分析 9
2.4.1 线性试验结果分析 9
2.4.2 单因素实验结果分析 9
2.4.3 正交试验结果及分析 11
2.4.4 验证试验 13
2.5 分析讨论 13
结论 16
参考文献 17
致谢 19
文献综述
凹叶厚朴简介
凹叶厚朴(Magnolia officinalis Rehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.)为木兰科木兰属厚朴植物(Magnolia officinalis Rehd.et Wils.)的变种，是我国特有的树种，具有很高的药用价值。厚朴在我国药用历史十分久远，可追溯到两千多年以前。除了在中药临床应用外，厚朴还是多种中成药的主要原料药。
?厚朴生长速度缓慢，时间一般比较长，要生长许多年后才能供药用，作为有较高药用价值的中药资源，凹叶厚朴在临床上多以复方入药，故用量很大，因厚朴药材的药用部位为干燥的根、皮，这就到导致这一资源的破坏，这极度不符合资源的合理利用和环境的保护，该物种的过度消耗，使该资源越来越少，甚至到了灭绝的地步，生产上虽然已经实现了大面积的规模种植，但从长远的角度来看，该资源还是不足，因此先后被列为国家二级保护中药材和国家二级保护植物[1]。
植物内生真菌的研究
高等植物不仅有自己特定的分类，且数量繁多，约有数十万种，由于植物生长环境的特殊性，植物体内有不计其数的生物类群，其中最主要的当属内生真菌(Endophytic fungi)，几乎所有的植物组织中都含有内生真菌。药用植物最主要的来源还是植物本身，内生真菌广泛分布于药用植物体内[2]。
植物内生真菌(Plant endophytic fungi)是属于天然组成成分，在生物发展史上有着极其丰富的代谢产物。1993年，Strobel等[3]从短叶红豆杉树皮的内生真菌中分离得到紫杉醇，这才被国内外学者极大关注。有大量研究报告指出，在现有的植物体中，其内生真菌也能够产生于宿主相同或者相似的次生代谢产物[4]。在此之后有关内生真菌产生生物活性物质的研究也随之增加。
内生真菌的多样性
迄今为止，很多的专家学者对药用植物的各个方面进行过研究，从微生物学角度上来看，根据已有的报道，还没有发现不产生内生真菌的植物[58]，由此可以推断在植物内存在着大量的内生真菌。真菌的类群组成复杂多样，且不同的真菌有不同的进化途径，有学者从内生真菌与宿主的专一性方面进行研究发现，平均有4~5种内生真菌专属于一种植物，就目前已知植物有25万种，通过这个数据统计计算会发现，内生真菌的总数会超过一千万种[9]。仝保慧等[10]从厚朴中就分离得到51株内生真菌。项勇等[11]在从东北红豆杉的树皮中分离出21株内生真菌，可见植物内生真菌有着丰富的种属多样性。
内生真菌代谢产物
随着研究的不断深入，微生物领域展现出广阔的发展趋势，寻找能产生生物活性的物质在微生物领域成为新的研究方向。张新国等[12]研究了6种药用植物，通过对植物内生真菌进行发酵提取，分离得到了43株内生真菌，并研究了内生真菌的抗氧化活性，结果表明，内生菌是寻找抗氧化活性的良好资源。周松林等[13]对内生真菌次代谢产物的研究进展情况进行了分类综述。结果表明，植物本身具有多样性、复杂性和特殊性，这使得源于其中的内生真菌也同样具有这些特性。
目前就对内生真菌代谢产物的提取方法研究甚多，丁海娥等[14]在做4种植物的内生真菌抑制活性提取物的研究时，采用乙酸乙酯为发酵液的提取溶剂，回流提取菌丝体，即而得到的各组分提取物。研究结果表明：药用植物的代谢产物具有一定的抑制活性。陈良立等[15]研究内生真菌代谢产物抗氧化及抑菌活性实验时，通过乙酸乙酯提取发酵液、菌丝体。实验结果发现：乙酸乙酯部位有较强的抗氧化和抑菌活性。王婉婷[16]在对植物内生真菌代谢产物中单胺氧化酶抑制剂作研究时，对发酵液用乙酸乙酯为溶剂超声萃取，之后再用正丁醇提取，研究并未对菌丝体有所提取，
1 文献综述
1.1 凹叶厚朴简介 1
1.2 植物内生真菌的研究 1
1.2.1 内生真菌的多样性 1
1.2.2 内生真菌代谢产物 2
1.3 超声波技术 2
1.3.1 超声波萃取技术在天然产物上的应用 3
1.3.2 超声波萃取技术在生物发酵工程中的应用 3
1.4 厚朴内生真菌代谢产物提取的研究 3
2 实验部分
2.1 实验材料 5
2.1.1 菌种来源 5
2.1.2 仪器 5
2.1.3 药品试剂 5
2.1.4 培养基的配制 5
2.2 实验方法 6
2.2.1 菌种复壮 6
2.2.2 液体发酵培养 6
2.2.3 发酵液的提取 6
2.2.4 菌丝体的提取 6
2.2.5 单因素试验设计 6
2.2.6 正交试验设计 7
2.3 凹叶厚朴内生真菌代谢产物厚朴酚的含量测定 7
2.3.1 仪器、药品与试剂 7
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
> 2.2.1 菌种复壮 6
2.2.2 液体发酵培养 6
2.2.3 发酵液的提取 6
2.2.4 菌丝体的提取 6
2.2.5 单因素试验设计 6
2.2.6 正交试验设计 7
2.3 凹叶厚朴内生真菌代谢产物厚朴酚的含量测定 7
2.3.1 仪器、药品与试剂 7
2.3.2 对照品溶液制备 7
2.3.3 供试品溶液的制备 7
2.3.4 色谱条件与系统适用性试验 8
2.3.5 线性关系考察 8
2.4 结果与分析 9
2.4.1 线性试验结果分析 9
2.4.2 单因素实验结果分析 9
2.4.3 正交试验结果及分析 11
2.4.4 验证试验 13
2.5 分析讨论 13
结论 16
参考文献 17
致谢 19
文献综述
凹叶厚朴简介
凹叶厚朴(Magnolia officinalis Rehd.et Wils.var.biloba Rehd.et Wils.)为木兰科木兰属厚朴植物(Magnolia officinalis Rehd.et Wils.)的变种，是我国特有的树种，具有很高的药用价值。厚朴在我国药用历史十分久远，可追溯到两千多年以前。除了在中药临床应用外，厚朴还是多种中成药的主要原料药。
?厚朴生长速度缓慢，时间一般比较长，要生长许多年后才能供药用，作为有较高药用价值的中药资源，凹叶厚朴在临床上多以复方入药，故用量很大，因厚朴药材的药用部位为干燥的根、皮，这就到导致这一资源的破坏，这极度不符合资源的合理利用和环境的保护，该物种的过度消耗，使该资源越来越少，甚至到了灭绝的地步，生产上虽然已经实现了大面积的规模种植，但从长远的角度来看，该资源还是不足，因此先后被列为国家二级保护中药材和国家二级保护植物[1]。
植物内生真菌的研究
高等植物不仅有自己特定的分类，且数量繁多，约有数十万种，由于植物生长环境的特殊性，植物体内有不计其数的生物类群，其中最主要的当属内生真菌(Endophytic fungi)，几乎所有的植物组织中都含有内生真菌。药用植物最主要的来源还是植物本身，内生真菌广泛分布于药用植物体内[2]。
植物内生真菌(Plant endophytic fungi)是属于天然组成成分，在生物发展史上有着极其丰富的代谢产物。1993年，Strobel等[3]从短叶红豆杉树皮的内生真菌中分离得到紫杉醇，这才被国内外学者极大关注。有大量研究报告指出，在现有的植物体中，其内生真菌也能够产生于宿主相同或者相似的次生代谢产物[4]。在此之后有关内生真菌产生生物活性物质的研究也随之增加。
内生真菌的多样性
迄今为止，很多的专家学者对药用植物的各个方面进行过研究，从微生物学角度上来看，根据已有的报道，还没有发现不产生内生真菌的植物[58]，由此可以推断在植物内存在着大量的内生真菌。真菌的类群组成复杂多样，且不同的真菌有不同的进化途径，有学者从内生真菌与宿主的专一性方面进行研究发现，平均有4~5种内生真菌专属于一种植物，就目前已知植物有25万种，通过这个数据统计计算会发现，内生真菌的总数会超过一千万种[9]。仝保慧等[10]从厚朴中就分离得到51株内生真菌。项勇等[11]在从东北红豆杉的树皮中分离出21株内生真菌，可见植物内生真菌有着丰富的种属多样性。
内生真菌代谢产物
随着研究的不断深入，微生物领域展现出广阔的发展趋势，寻找能产生生物活性的物质在微生物领域成为新的研究方向。张新国等[12]研究了6种药用植物，通过对植物内生真菌进行发酵提取，分离得到了43株内生真菌，并研究了内生真菌的抗氧化活性，结果表明，内生菌是寻找抗氧化活性的良好资源。周松林等[13]对内生真菌次代谢产物的研究进展情况进行了分类综述。结果表明，植物本身具有多样性、复杂性和特殊性，这使得源于其中的内生真菌也同样具有这些特性。
目前就对内生真菌代谢产物的提取方法研究甚多，丁海娥等[14]在做4种植物的内生真菌抑制活性提取物的研究时，采用乙酸乙酯为发酵液的提取溶剂，回流提取菌丝体，即而得到的各组分提取物。研究结果表明：药用植物的代谢产物具有一定的抑制活性。陈良立等[15]研究内生真菌代谢产物抗氧化及抑菌活性实验时，通过乙酸乙酯提取发酵液、菌丝体。实验结果发现：乙酸乙酯部位有较强的抗氧化和抑菌活性。王婉婷[16]在对植物内生真菌代谢产物中单胺氧化酶抑制剂作研究时，对发酵液用乙酸乙酯为溶剂超声萃取，之后再用正丁醇提取，研究并未对菌丝体有所提取，
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