转灰飞虱cyp6ay3v2和cyp353d1v2基因果蝇的生物测定
本研究利用超量表达灰飞虱CYP6AY3v2和CYP353D1v2基因的转基因果蝇，通过生物测定检测了CYP6AY3v2和CYP353D1v2过量表达对果蝇抗性的影响。结果表明超量表达灰飞虱CYP6AY3v2的果蝇品系tub＞CYP6AY3v2对乙虫腈、灭多威和氟虫腈的抗药性都有提高，抗性倍数分别为3.17、4.01和1.45。超量表达灰飞虱CYP353D1v2的果蝇品系tub＞CYP353D1v2对乙虫腈和灭多威的抗药性都有提高，抗性倍数分别为2.22和7.22；但对氟虫腈的抗性没有提高。因此，灰飞虱CYP6AY3v2可能参与乙虫腈、灭多威和氟虫腈的解毒代谢；CYP353D1v2可能参与乙虫腈和灭多威的解毒代谢；此外，灰飞虱CYP6AY3v2和CYP353D1v2基因的过量表达是灰飞虱对多种杀虫剂产生交互抗性的机制之一。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1供试果蝇品系2
1.2果蝇的饲养2
1.3供试农药2
1.4杀虫剂配制3
1．5农药生物测定方法3
2结果与分析3
2．1转灰飞虱CYP6AY3v2果蝇品系对不同杀虫剂的敏感性测定3
2. 2转灰飞虱CYP353D1v2果蝇品系对不同杀虫剂的敏感性测定5
3 讨论6
致谢7
参考文献7
转灰飞虱CYP6AY3v2和CYP353D1v2基因果蝇的生物测定
引言
引言：灰飞虱（Laodelphax striatellus），属于半翅目飞虱科、灰飞虱属，广泛分布于从菲律宾至西伯利亚的亚洲稻区和欧洲的温带地区[1]。灰飞虱是一种寄主广泛、取食多样的昆虫，以取食小麦、大麦、水稻、玉米、谷子、高梁等多种禾本科植物为主[2]。由于化学杀虫剂的长期、大量不合理施用、滥用，导致灰飞虱对多种杀虫剂产生了抗药性[3]。
昆虫对杀虫剂的抗性主要涉及表皮穿透速率降低，解毒代谢能力增强和靶标部位敏感性降低。灰飞虱对于杀虫剂的抗药性机理也同样包含以上的几个方面。由于昆虫对外界环境的长 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
期适应，当杀虫剂通过昆虫的口腔、气门和体壁进入虫体后，昆虫可以通过体内一系列解毒酶将有毒、有害的化学物质氧化、还原、水解或结合后，降低其毒性，增强其水溶性，最后排出体外，从而达到解毒的目的[4]。其中多功能氧化酶系（MFOs）、酯酶（EST）和谷胱甘肽S转移酶（GSTs）起着关键性作用[5]。
本研究前期通过灰飞虱抗性品系与敏感品系的比较，发现细胞色素P450s在抗性灰飞虱中起着重要作用。并且发现灰飞虱CYP6AY3v2和CYP353D1v2基因在抗吡虫啉[6]，抗毒死蜱和抗溴氰菊酯等多个灰飞虱抗性品系中都有过量表达的现象；通过转基因果蝇超量表达技术证实了灰飞虱CYP6AY3v2和CYP353D1v2基因的过量表达对吡虫啉，毒死蜱和溴氰菊酯的抗性。因此，本文在前期基础上，进一步对转基因果蝇进行生物测定，探讨灰飞虱CYP6AY3v2和CYP353D1v2对其他杀虫剂的解毒代谢作用，试图阐明它们在交互抗性中起的作用。
1 材料与方法
1.1供试果蝇品系
杂交实验中所用雌性果蝇，均为处女蝇，每组杂交比例♀：♂为2:1。
供农药生物测定的果蝇是品系如下：
实验品系：
1．tub> CYP6AY3v2（UASCYP6AY3v2♂× tubGal4♀杂交后代）
2．tub> CYP353D1v2（UASCYP353D1v2♂× tubGal4♀杂交后代）
对照品系：
1．UASCYP6AY3v2
2．UASCYP353D1v2
1.2 果蝇的饲养
果蝇用由玉米粉、酵母粉、白糖和琼脂做成的人工饲料（配方见表21）饲养。实验室饲养条件为：光周期为14L：10D，温度为（25±2）℃，相对湿度为60%~70%。
表1果蝇饲料配方
成分名称
含量（/800mL）
玉米粉(cornmeal)
68 g
酵母粉(yeast)
18 g
白糖(sugar)
52 g
琼脂(agar)
6 g
尼泊金甲酯(methylparaben)
0.52 g
1.3供试农药
95%乙虫腈原药，由南京红太阳集团生产。为浅黄色晶体粉末，无特别气味。该药属第二代作用于GABA的杀虫剂低用量下对多种咀嚼式和刺吸式害虫有效。其作用机制是通过一氨基丁酸（GABA）干扰氯离子通道，从而破坏中枢神经系统（CNS）正常活动，使昆虫致死。与有机磷类，拟除虫菊酯，氨基甲酸酯类等主要的杀虫剂不存在交互抗性问题，其作用方式为触杀性，不具内吸性。
98.5%灭多威原药，由南京红太阳集团生产。白色晶体粉末，略具有硫磺的气味。该药属内吸性氨基甲酸酯类杀虫剂，作用于害虫的胆碱酯酶，破坏害虫的神经系统，使其死亡。具有触杀和胃毒作用、熏蒸作用，渗透力强，具有一定的杀卵效果，对有机磷和菊酯类已经产生抗性的害虫也有较好防效。适用于棉花、蔬菜、烟草上防治鳞翅目、同翅目、鞘翅目及其他螨类害虫[7]。
98%氟虫腈原药，由南京红太阳集团生产。白色固体。该药属苯基吡唑类杀虫剂、杀虫谱广，对害虫以胃毒作用为主，兼有触杀和一定的内吸作用，其作用机制在于阻碍昆虫γ氨基丁酸控制的氯化物代谢，因此对蚜虫、叶蝉、飞虱、鳞翅目幼虫、蝇类和鞘翅目等重要害虫有很高的杀虫活性，对作物无药害。该药剂可施于土壤，也可叶面喷雾。施于土壤能有效防治玉米根叶甲、金针虫和地老虎。叶面喷洒时，对小菜蛾、菜粉蝶、稻蓟马等均有高水平防效，且持效期长。
1.4杀虫剂配制
以丙酮（分析纯）为溶剂，将杀虫剂原药配制成浓度为10000 mgL1的母液。根据预实验确定适合的杀虫剂的浓度，然后用丙酮按一定倍数梯度稀释杀虫剂，用于生物测定。本实验乙虫腈和灭多威分别配制五个浓度梯度，氟虫腈配制六个浓度梯度,三种药剂都用丙酮为对照浓度。。
1.5农药生物测定方法
以超量表达靶基因的果蝇品系为实验组，以未超量表达靶基因的果蝇为对照组。选取羽化45天的雌果蝇进行试验。供试果蝇：每个浓度设3组重复，每组20头试虫。将供试果蝇置于通有 CO2的果蝇管中麻痹1 min左右，迅速用毛刷将其平铺于托盘上，取0.25 μl 的不同浓度的供试药剂用自动微量点滴仪（Burkard 公司）点滴于果蝇前胸背板中央，以点滴丙酮作为对照。从低浓度到高浓度依次点滴，更换不同浓度药剂时，应用丙酮将注射器和针头洗涤5~6次，然后量取待测农药。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1供试果蝇品系2
1.2果蝇的饲养2
1.3供试农药2
1.4杀虫剂配制3
1．5农药生物测定方法3
2结果与分析3
2．1转灰飞虱CYP6AY3v2果蝇品系对不同杀虫剂的敏感性测定3
2. 2转灰飞虱CYP353D1v2果蝇品系对不同杀虫剂的敏感性测定5
3 讨论6
致谢7
参考文献7
转灰飞虱CYP6AY3v2和CYP353D1v2基因果蝇的生物测定
引言
引言：灰飞虱（Laodelphax striatellus），属于半翅目飞虱科、灰飞虱属，广泛分布于从菲律宾至西伯利亚的亚洲稻区和欧洲的温带地区[1]。灰飞虱是一种寄主广泛、取食多样的昆虫，以取食小麦、大麦、水稻、玉米、谷子、高梁等多种禾本科植物为主[2]。由于化学杀虫剂的长期、大量不合理施用、滥用，导致灰飞虱对多种杀虫剂产生了抗药性[3]。
昆虫对杀虫剂的抗性主要涉及表皮穿透速率降低，解毒代谢能力增强和靶标部位敏感性降低。灰飞虱对于杀虫剂的抗药性机理也同样包含以上的几个方面。由于昆虫对外界环境的长 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
期适应，当杀虫剂通过昆虫的口腔、气门和体壁进入虫体后，昆虫可以通过体内一系列解毒酶将有毒、有害的化学物质氧化、还原、水解或结合后，降低其毒性，增强其水溶性，最后排出体外，从而达到解毒的目的[4]。其中多功能氧化酶系（MFOs）、酯酶（EST）和谷胱甘肽S转移酶（GSTs）起着关键性作用[5]。
本研究前期通过灰飞虱抗性品系与敏感品系的比较，发现细胞色素P450s在抗性灰飞虱中起着重要作用。并且发现灰飞虱CYP6AY3v2和CYP353D1v2基因在抗吡虫啉[6]，抗毒死蜱和抗溴氰菊酯等多个灰飞虱抗性品系中都有过量表达的现象；通过转基因果蝇超量表达技术证实了灰飞虱CYP6AY3v2和CYP353D1v2基因的过量表达对吡虫啉，毒死蜱和溴氰菊酯的抗性。因此，本文在前期基础上，进一步对转基因果蝇进行生物测定，探讨灰飞虱CYP6AY3v2和CYP353D1v2对其他杀虫剂的解毒代谢作用，试图阐明它们在交互抗性中起的作用。
1 材料与方法
1.1供试果蝇品系
杂交实验中所用雌性果蝇，均为处女蝇，每组杂交比例♀：♂为2:1。
供农药生物测定的果蝇是品系如下：
实验品系：
1．tub> CYP6AY3v2（UASCYP6AY3v2♂× tubGal4♀杂交后代）
2．tub> CYP353D1v2（UASCYP353D1v2♂× tubGal4♀杂交后代）
对照品系：
1．UASCYP6AY3v2
2．UASCYP353D1v2
1.2 果蝇的饲养
果蝇用由玉米粉、酵母粉、白糖和琼脂做成的人工饲料（配方见表21）饲养。实验室饲养条件为：光周期为14L：10D，温度为（25±2）℃，相对湿度为60%~70%。
表1果蝇饲料配方
成分名称
含量（/800mL）
玉米粉(cornmeal)
68 g
酵母粉(yeast)
18 g
白糖(sugar)
52 g
琼脂(agar)
6 g
尼泊金甲酯(methylparaben)
0.52 g
1.3供试农药
95%乙虫腈原药，由南京红太阳集团生产。为浅黄色晶体粉末，无特别气味。该药属第二代作用于GABA的杀虫剂低用量下对多种咀嚼式和刺吸式害虫有效。其作用机制是通过一氨基丁酸（GABA）干扰氯离子通道，从而破坏中枢神经系统（CNS）正常活动，使昆虫致死。与有机磷类，拟除虫菊酯，氨基甲酸酯类等主要的杀虫剂不存在交互抗性问题，其作用方式为触杀性，不具内吸性。
98.5%灭多威原药，由南京红太阳集团生产。白色晶体粉末，略具有硫磺的气味。该药属内吸性氨基甲酸酯类杀虫剂，作用于害虫的胆碱酯酶，破坏害虫的神经系统，使其死亡。具有触杀和胃毒作用、熏蒸作用，渗透力强，具有一定的杀卵效果，对有机磷和菊酯类已经产生抗性的害虫也有较好防效。适用于棉花、蔬菜、烟草上防治鳞翅目、同翅目、鞘翅目及其他螨类害虫[7]。
98%氟虫腈原药，由南京红太阳集团生产。白色固体。该药属苯基吡唑类杀虫剂、杀虫谱广，对害虫以胃毒作用为主，兼有触杀和一定的内吸作用，其作用机制在于阻碍昆虫γ氨基丁酸控制的氯化物代谢，因此对蚜虫、叶蝉、飞虱、鳞翅目幼虫、蝇类和鞘翅目等重要害虫有很高的杀虫活性，对作物无药害。该药剂可施于土壤，也可叶面喷雾。施于土壤能有效防治玉米根叶甲、金针虫和地老虎。叶面喷洒时，对小菜蛾、菜粉蝶、稻蓟马等均有高水平防效，且持效期长。
1.4杀虫剂配制
以丙酮（分析纯）为溶剂，将杀虫剂原药配制成浓度为10000 mgL1的母液。根据预实验确定适合的杀虫剂的浓度，然后用丙酮按一定倍数梯度稀释杀虫剂，用于生物测定。本实验乙虫腈和灭多威分别配制五个浓度梯度，氟虫腈配制六个浓度梯度,三种药剂都用丙酮为对照浓度。。
1.5农药生物测定方法
以超量表达靶基因的果蝇品系为实验组，以未超量表达靶基因的果蝇为对照组。选取羽化45天的雌果蝇进行试验。供试果蝇：每个浓度设3组重复，每组20头试虫。将供试果蝇置于通有 CO2的果蝇管中麻痹1 min左右，迅速用毛刷将其平铺于托盘上，取0.25 μl 的不同浓度的供试药剂用自动微量点滴仪（Burkard 公司）点滴于果蝇前胸背板中央，以点滴丙酮作为对照。从低浓度到高浓度依次点滴，更换不同浓度药剂时，应用丙酮将注射器和针头洗涤5~6次，然后量取待测农药。
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