一氧化氮对猪圆环病毒ⅱ体外复制的影响研究
本文研究了外源性NO对猪圆环病毒Ⅱ型体外增殖的影响。先采用MTT法测量药物的细胞毒性，经证实本试验中采用的三种不同浓度（400μM，200μM，100μM）的L-Arg和一种浓度的L-瓜氨酸不具有细胞毒性。然后采用不同浓度（400μM，200μM，100μM）的L-精氨酸（L-Arg）分别作用于PK-15和3D4/21细胞，接种PCV2，感染72h后，测定细胞上清中NO水平，并且提取DNA检测病毒DNA拷贝数。结果表明，NO前体物L-Arg能够有效地诱导PK-15细胞和3D4/21细胞产生NO，进而显著地抑制PCV2在细胞内的复制，其抑制效果与L-Arg的浓度呈正相关，即证实了NO对PCV2复制的抑制作用。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1试验试剂 2
1.1.1 PBS溶液的配制2
1.1.2 MTT溶液的配制2
1.1.3 Griess试剂的配制2
1.2仪器和设备 2
1.3细胞复苏2
1.4细胞传代培养3
1.5 MTT法细胞毒性试验3
1.6药物对细胞产生NO的诱导作用3
1.6.1 NO标准曲线测定3
1.6.2药物诱导作用试验4
1.7 PCV2 DNA拷贝数测定4
1.8数据处理和统计方法5
2实验结果5
2.1细胞毒性试验5
2.2药物对细胞产生NO的影响6
2.3 NO对PCV2复制的影响7
3讨论 7
致谢8
参考文献8
一氧化氮对猪圆环病毒Ⅱ型体外复制的影响研究
引言
引言：猪圆环病毒 (porcine circovirus，PCV) 属于圆环病毒科圆环病毒属，目前已发现其存在PCV1和PCV2两种基因型，PCV1无致病性[1]。PCV2感染及其与宿主免疫系统的相互作用是引起断奶仔猪多系统衰竭（postweaning multisystemic wasting s *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
yndrome, PMWS）、猪皮炎肾病综合征（porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS）等圆环病毒病（porcine circovirus associated disease，PCVAD）的关键，其中临床最常见的是PMWS。同时PCV2也是目前养猪业危害最大的病原之一，PMWA可以造成512周龄的仔猪进行性消瘦或生长迟缓，因而对养猪业产生严重影响并造成巨大的经济损失[24]。PCV2既可以水平传播[5]，也可以垂直传播[6]，通过粪便、尿液、乳汁、血清和精液等多种方式排毒[79]，还可与其他细菌、病毒及寄生虫等混合感染，防控难度非常大[10]。目前，PCV2致病机理仍不明确，也没有针对该病毒的特效药，猪场主要依靠疫苗预防 PCVAD 的爆发，但是受到多种因素影响，PCV2 疫苗的保护率也经常不尽人意。
NO是一种难溶于水的脂溶性气体，因为它的分子结构中具有不配对的电子，所以它是一种自由基。体内的NO来源于L精氨酸中胍基氮原子和氧分子，催化这一反应的酶为一氧化氮合酶（NOS）[11]。20世纪80年代，科学家发现一氧化氮 (NO) 具有舒张血管平滑肌的作用，揭示了该小分子化合物的生物学活性，自此，NO激起了科学界的研究热潮[1214]。大量研究表明，NO作为一种重要的信号分子，具有复杂多样的病理、生理作用，它能抵抗或杀灭多种病原微生物，包括细菌、寄生虫、真菌和蠕虫等，还能抑制多种 DNA、RNA 病毒复制和感染，在病毒的临床诊断和治疗中都表现出重要的作用[15,16]。NO在体内、体外具有抑制 PCV2 复制的活性，然而，其抑制机理仍不清楚，揭示其机理将为PCVAD 防控提供必要的理论依据和全新的视野。
1.材料和方法：
1.1试验试剂：
本试验采用的试剂L精氨酸(LArginine）、L瓜氨酸(LCitrulline）、亚硝酸(sodiumnitrite）、氨基胍盐酸盐（aminoguanidine，AG）均购于Sigma公司。
1.1.1 PBS溶液的配制方法：
NaCl 8g + KCl 0.2g + Na2HPO4 1.44g + KH2PO4 0.24g调pH 7.4,定容1L。
1.1.2 MTT溶液的配制方法：
称取MTT（噻唑蓝，购于Sigma公司） 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液(PBS)中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃ 避光保存。配制MTT时用PBS(Ph=7.4)溶解。
1.1.3 Griess试剂的配制方法：
10mM NaNO2标准储存液的配制：精确称取NaNO26.9mg，加去离子水定容至10ml，即为10mM NaNO2标准储存液。
试剂A：浓磷酸（85%）6ml，去离子水70ml，无水2,5对氨基苯磺酸（2,5Diaminobenzenesulfonic acid，购于Sigma公司）1.0g。将上述试剂充分溶解后，定容至100ml。
试剂B：N（1萘基）乙二胺二盐酸盐（N(1Naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride，购于Sigma公司）0.1g，溶于去离子水中，定容至100ml。
1.2仪器和设备：
酶标仪(Sunrise, TECAN Co., Swiss)，倒置显微镜，thermo细胞培养箱，ABI7500实时荧光定量PCR仪。
1.3细胞复苏
从液氮中取出冷冻管迅速放入38℃水浴中，在1分钟内使其完全融化，然后在超净台中操作，加入适量培养液后接种于细胞瓶中，置于37℃，5%CO2温箱中静置培养，次日更换一次培养液，继续培养。观察生长状况。细胞密度合适时传代。
1.4细胞传代培养
取出细胞瓶置于显微镜下观察细胞形态和密度，确定细胞生长状况。在确定细胞生长状况良好的情况下，用适量PBS清洗细胞表面2次，弃去PBS。加入适量胰酶置于37℃温箱中消化细胞（1ml），待完全消化后，加入适量培养液终止消化，并吹打细胞瓶瓶壁使贴壁的细胞脱落并且混匀。吸取适量细胞液加入新的细胞瓶内，加10ml 8% DMEM，标记细胞名称、传代日期并放入温箱培养。
1.5 MTT法细胞毒性试验
细胞按照1×104/孔加入96孔细胞培养板内，培养基为含8% 胎牛血清的DMEM。当每孔细胞长到50%时，弃掉培养基，用PBS (0.01 M, pH 7.2) 洗两遍，然后各孔加入不同浓度（如下表）的LArg或L瓜氨酸培养(这些药物溶解于含有2% 胎牛血清的DMEM 中，然后用0.22μm微孔滤膜过滤)，每个浓度设八个重复孔。培养72 小时后，弃掉药物，PBS洗涤，每孔加入20μlMTT溶液，继续培养4h后终止培养，弃去孔内培养液，每孔加入150μl二甲基亚砜，置于摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。各细胞孔540 nm 的吸光度值(A540)由酶标仪(Sunrise, TECAN Co., Swiss)测定。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1试验试剂 2
1.1.1 PBS溶液的配制2
1.1.2 MTT溶液的配制2
1.1.3 Griess试剂的配制2
1.2仪器和设备 2
1.3细胞复苏2
1.4细胞传代培养3
1.5 MTT法细胞毒性试验3
1.6药物对细胞产生NO的诱导作用3
1.6.1 NO标准曲线测定3
1.6.2药物诱导作用试验4
1.7 PCV2 DNA拷贝数测定4
1.8数据处理和统计方法5
2实验结果5
2.1细胞毒性试验5
2.2药物对细胞产生NO的影响6
2.3 NO对PCV2复制的影响7
3讨论 7
致谢8
参考文献8
一氧化氮对猪圆环病毒Ⅱ型体外复制的影响研究
引言
引言：猪圆环病毒 (porcine circovirus，PCV) 属于圆环病毒科圆环病毒属，目前已发现其存在PCV1和PCV2两种基因型，PCV1无致病性[1]。PCV2感染及其与宿主免疫系统的相互作用是引起断奶仔猪多系统衰竭（postweaning multisystemic wasting s *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
yndrome, PMWS）、猪皮炎肾病综合征（porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS）等圆环病毒病（porcine circovirus associated disease，PCVAD）的关键，其中临床最常见的是PMWS。同时PCV2也是目前养猪业危害最大的病原之一，PMWA可以造成512周龄的仔猪进行性消瘦或生长迟缓，因而对养猪业产生严重影响并造成巨大的经济损失[24]。PCV2既可以水平传播[5]，也可以垂直传播[6]，通过粪便、尿液、乳汁、血清和精液等多种方式排毒[79]，还可与其他细菌、病毒及寄生虫等混合感染，防控难度非常大[10]。目前，PCV2致病机理仍不明确，也没有针对该病毒的特效药，猪场主要依靠疫苗预防 PCVAD 的爆发，但是受到多种因素影响，PCV2 疫苗的保护率也经常不尽人意。
NO是一种难溶于水的脂溶性气体，因为它的分子结构中具有不配对的电子，所以它是一种自由基。体内的NO来源于L精氨酸中胍基氮原子和氧分子，催化这一反应的酶为一氧化氮合酶（NOS）[11]。20世纪80年代，科学家发现一氧化氮 (NO) 具有舒张血管平滑肌的作用，揭示了该小分子化合物的生物学活性，自此，NO激起了科学界的研究热潮[1214]。大量研究表明，NO作为一种重要的信号分子，具有复杂多样的病理、生理作用，它能抵抗或杀灭多种病原微生物，包括细菌、寄生虫、真菌和蠕虫等，还能抑制多种 DNA、RNA 病毒复制和感染，在病毒的临床诊断和治疗中都表现出重要的作用[15,16]。NO在体内、体外具有抑制 PCV2 复制的活性，然而，其抑制机理仍不清楚，揭示其机理将为PCVAD 防控提供必要的理论依据和全新的视野。
1.材料和方法：
1.1试验试剂：
本试验采用的试剂L精氨酸(LArginine）、L瓜氨酸(LCitrulline）、亚硝酸(sodiumnitrite）、氨基胍盐酸盐（aminoguanidine，AG）均购于Sigma公司。
1.1.1 PBS溶液的配制方法：
NaCl 8g + KCl 0.2g + Na2HPO4 1.44g + KH2PO4 0.24g调pH 7.4,定容1L。
1.1.2 MTT溶液的配制方法：
称取MTT（噻唑蓝，购于Sigma公司） 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液(PBS)中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃ 避光保存。配制MTT时用PBS(Ph=7.4)溶解。
1.1.3 Griess试剂的配制方法：
10mM NaNO2标准储存液的配制：精确称取NaNO26.9mg，加去离子水定容至10ml，即为10mM NaNO2标准储存液。
试剂A：浓磷酸（85%）6ml，去离子水70ml，无水2,5对氨基苯磺酸（2,5Diaminobenzenesulfonic acid，购于Sigma公司）1.0g。将上述试剂充分溶解后，定容至100ml。
试剂B：N（1萘基）乙二胺二盐酸盐（N(1Naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride，购于Sigma公司）0.1g，溶于去离子水中，定容至100ml。
1.2仪器和设备：
酶标仪(Sunrise, TECAN Co., Swiss)，倒置显微镜，thermo细胞培养箱，ABI7500实时荧光定量PCR仪。
1.3细胞复苏
从液氮中取出冷冻管迅速放入38℃水浴中，在1分钟内使其完全融化，然后在超净台中操作，加入适量培养液后接种于细胞瓶中，置于37℃，5%CO2温箱中静置培养，次日更换一次培养液，继续培养。观察生长状况。细胞密度合适时传代。
1.4细胞传代培养
取出细胞瓶置于显微镜下观察细胞形态和密度，确定细胞生长状况。在确定细胞生长状况良好的情况下，用适量PBS清洗细胞表面2次，弃去PBS。加入适量胰酶置于37℃温箱中消化细胞（1ml），待完全消化后，加入适量培养液终止消化，并吹打细胞瓶瓶壁使贴壁的细胞脱落并且混匀。吸取适量细胞液加入新的细胞瓶内，加10ml 8% DMEM，标记细胞名称、传代日期并放入温箱培养。
1.5 MTT法细胞毒性试验
细胞按照1×104/孔加入96孔细胞培养板内，培养基为含8% 胎牛血清的DMEM。当每孔细胞长到50%时，弃掉培养基，用PBS (0.01 M, pH 7.2) 洗两遍，然后各孔加入不同浓度（如下表）的LArg或L瓜氨酸培养(这些药物溶解于含有2% 胎牛血清的DMEM 中，然后用0.22μm微孔滤膜过滤)，每个浓度设八个重复孔。培养72 小时后，弃掉药物，PBS洗涤，每孔加入20μlMTT溶液，继续培养4h后终止培养，弃去孔内培养液，每孔加入150μl二甲基亚砜，置于摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。各细胞孔540 nm 的吸光度值(A540)由酶标仪(Sunrise, TECAN Co., Swiss)测定。
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/yxlw/dwyx/641.html
