不同日粮氮水平对断奶仔猪胃液分泌的影响
不同日粮氮水平对断奶仔猪胃液分泌的影响[20200510204252]
摘要：本试验设置标准蛋白、低蛋白、超低蛋白日粮，研究不同蛋白水平日粮对断奶仔猪胃蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅱ，胃液ph值和胃蛋白酶分泌的影响。选取杜长大杂交仔猪54头，28d断奶，预饲3天，随机分为三组，分别饲喂标准蛋白日粮（20%）、低蛋白日粮（17%）和超低蛋白日粮（14%），每组18头，分别在断奶饲养的第10d、25d、45d、每组随机选六头屠宰取样。结果表明：不同蛋白水平日粮对胃蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅱ和胃液ph值大小分泌影响不显著；不同蛋白水平日粮显著影响胃蛋白酶的活性，且随着蛋白水平的降低，胃蛋白酶含量也相应减少。断奶仔猪日粮氮水平的研究，为避免环境污染、提高氮利用效率的途径奠定基础。
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关键字:断奶仔猪；胃蛋白酶；ph值；胃蛋白酶原
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1.1 主要仪器用品 2
1.2 日粮设计 2
1.3 试验动物及设计 2
1.4 样品采集 2
1.5 血清样品的制备与分析 2
1.6 胃液ph值的测定 3
1.7 胃蛋白酶的测定 3
1.8 数据分析 3
2 结果与分析 3
2.1 日粮蛋白水平对胃蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅱ的影响 3
2.2 日粮蛋白水平对胃液ph值的影响 4
2.3 日粮蛋白水平对胃蛋白酶的影响 4
3 讨论 4
致谢 5
参考文献 5
不同日粮氮水平对断奶仔猪胃液分泌的影响
引言
胃蛋白酶原(PG)是胃蛋白酶的无活性前体，为一个375个氨基酸合成的蛋白多肽链，人胃粘膜中有7组胃蛋白酶同工酶原，相对分子质量平均为42,000。胃蛋白酶在核糖体上进行合成，后经高尔基体分泌出细胞，被盐酸激活后即可变成胃蛋白酶[1]。
猪在初生时胃酸分泌的能力很低，出生后一周内胃酸分泌的能力快速增加，但仔猪胃酸中的游离酸非常少，直到20日龄的时候才逐渐出现游离盐酸，至2-3月龄左右盐酸分泌量才接近成猪水平。研究表明，胃蛋白酶原在断奶后含量稍降低或不变，但断奶后胃中ph值升高明显，从而使仔猪断奶后胃蛋白酶活性降低，对蛋白质的消化能力减弱，易发生腹泻[2]。不同蛋白水平的日粮对断奶仔猪的影响不同，在考虑了猪种、养殖场地等因素后，能较精确地确定合适的日粮蛋白水平。目前探讨不同蛋 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
白水平饲料对消化酶的研究中，对于水产类（对虾，罗氏沼虾，宝石鲈）的日粮蛋白水平研究较多，对虾家系的胃蛋白酶活性均随着饲料蛋白含量（蛋白水平范围34-42%）的增加而增加[3]；不同蛋白水平对罗氏沼虾胃蛋白酶比活性影响显著，且随着饲料蛋白水平（蛋白水平范围20.2-51.2%）的上升，胃蛋白酶的比活性也呈上升趋势，表明罗氏沼虾胃蛋白酶活性对饲料中蛋白含量有适应性反应[4]；宝石鲈随着饲料蛋白水平的增加（蛋白水平范围23.64-41.62%），胃蛋白酶活性也增加[5]。但国内外对哺乳类家畜尤其是仔猪的蛋白水平对消化酶的影响研究较少。
仔猪刚断奶后，若没有合理的蛋白水平日粮让其快速适应没有母乳的饲料饲喂，就会使仔猪因为断乳而腹泻，从而导致体重减轻、免疫力下降和死亡率上升[6]。胃部的消化吸收对于整个消化系统来说是非常重要的，胃部含有多种消化酶，能促进饲料进行消化，而胃蛋白酶在其中起到至关重要的作用，同时胃部的胃液和其它消化液的酸度（ph值）是食糜的直接环境。因日粮蛋白水平过高，胃肠消化会有未吸收的蛋白质（粪和尿），这些过量的蛋白质不仅会对仔猪生长发育产生影响，也会造成环境污染，造成资源浪费。本实验拟研究不同蛋白水平日粮对断奶仔猪胃液分泌的影响，为找出提高氮利用的途径提供佐证。
1 材料与方法
1.1 主要仪器用品
胃蛋白酶试剂盒（北京鑫方程生物技术有限公司，批次201310）；酶标仪（芬兰，仪器型号352）；洗板机（芬兰，仪器型号AC8）；微量高速离心机（仪器型号TG16W）；隔水式恒温培养箱（仪器型号：GNP-9080）。
1.2日粮设计
本试验采用玉米－豆粕型日粮，参考NRC（2012）以及理想氨基酸模型，形成断奶仔猪（10-30 kg）的日粮配方。每个阶段设计标准（20%CP）、低(17%CP)、超低(14%CP)3个蛋白水平，同时必需氨基酸（赖、蛋、苏、色）的含量保持一致，从而造成必需氨基酸:非必需氨基酸的差异。研究在满足必需氨基酸需要量和适宜比例的条件下，猪胃蛋白酶酶分泌表观差异的规律。
1.3 试验动物及设计
选取28d断奶，环境适应期7d，杜长大三元杂交仔猪54头（10kg），将仔猪随机分为三组，每组18个头，每个重复1头猪，单栏饲养；三组实验猪分别饲喂标准（20%CP）、低（17%CP）、超低（14%CP）蛋白日粮；预饲期3d，仔猪实验期45d，并分别在第10d、25d、45d每组随机选6头前腔静脉采血，并屠宰采样。
1.4 样品采集
实验正式开始后第10d、25d和45d对试验猪前腔静脉取血屠宰并采集样品。样品包括：胃食糜，-20℃保存；血液样品。
1.5 血清样品的制备与分析
采集血液后，将血液样品在-20℃下静置3-4小时，后以4000rpm/min离心15min，小心将上清液移入灭菌后的Eppendorf管，后立刻将样品送至北京方程生物有限公司使用ELISA方法进行血清蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅱ的测定分析。
ELISA方法操作步骤：
（1）标准品的稀释与加样：标准品按照说明书稀释好五个梯度，各个梯度每孔加样量都为50μl；
（2）加样：分别设空白孔、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
40μl，然后再加待测样品10μl。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；
（3）温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟；
（4）配液洗涤：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用；小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
（5）加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外；
（6）温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟；
（7）洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
（8）显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；
（9）终止：每孔加终止液50μl，终止反应；
（10）测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行；
（11）计算：
以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标 准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
1.6 胃液ph值的测定
将胃食糜样品于-20℃取出，先解冻，涡旋，取样，后以6000rmp/min离心10min。取上清液，室温进行pH测定。
选用与样品液ph值相差不超过2个ph单位的标准溶液校准仪器。从第一个标准溶液中取出两个电极，彻底冲洗，并用滤纸吸干。再浸入第二个标准溶液，其ph值大约与前一个相差3个ph单位。若测定值与第二个标准溶液ph值之差0.1ph值时，就需要检查仪器、电极或标准溶液。当三者均无异常则可测定样品液。
样品液的测定：先用水仔细冲洗两个电极，后用样品液冲洗，将电极浸入水样中，小心摇动或搅拌使其均匀，待读数稳定后逐一记录ph值。
摘要：本试验设置标准蛋白、低蛋白、超低蛋白日粮，研究不同蛋白水平日粮对断奶仔猪胃蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅱ，胃液ph值和胃蛋白酶分泌的影响。选取杜长大杂交仔猪54头，28d断奶，预饲3天，随机分为三组，分别饲喂标准蛋白日粮（20%）、低蛋白日粮（17%）和超低蛋白日粮（14%），每组18头，分别在断奶饲养的第10d、25d、45d、每组随机选六头屠宰取样。结果表明：不同蛋白水平日粮对胃蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅱ和胃液ph值大小分泌影响不显著；不同蛋白水平日粮显著影响胃蛋白酶的活性，且随着蛋白水平的降低，胃蛋白酶含量也相应减少。断奶仔猪日粮氮水平的研究，为避免环境污染、提高氮利用效率的途径奠定基础。
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关键字:断奶仔猪；胃蛋白酶；ph值；胃蛋白酶原
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1.1 主要仪器用品 2
1.2 日粮设计 2
1.3 试验动物及设计 2
1.4 样品采集 2
1.5 血清样品的制备与分析 2
1.6 胃液ph值的测定 3
1.7 胃蛋白酶的测定 3
1.8 数据分析 3
2 结果与分析 3
2.1 日粮蛋白水平对胃蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅱ的影响 3
2.2 日粮蛋白水平对胃液ph值的影响 4
2.3 日粮蛋白水平对胃蛋白酶的影响 4
3 讨论 4
致谢 5
参考文献 5
不同日粮氮水平对断奶仔猪胃液分泌的影响
引言
胃蛋白酶原(PG)是胃蛋白酶的无活性前体，为一个375个氨基酸合成的蛋白多肽链，人胃粘膜中有7组胃蛋白酶同工酶原，相对分子质量平均为42,000。胃蛋白酶在核糖体上进行合成，后经高尔基体分泌出细胞，被盐酸激活后即可变成胃蛋白酶[1]。
猪在初生时胃酸分泌的能力很低，出生后一周内胃酸分泌的能力快速增加，但仔猪胃酸中的游离酸非常少，直到20日龄的时候才逐渐出现游离盐酸，至2-3月龄左右盐酸分泌量才接近成猪水平。研究表明，胃蛋白酶原在断奶后含量稍降低或不变，但断奶后胃中ph值升高明显，从而使仔猪断奶后胃蛋白酶活性降低，对蛋白质的消化能力减弱，易发生腹泻[2]。不同蛋白水平的日粮对断奶仔猪的影响不同，在考虑了猪种、养殖场地等因素后，能较精确地确定合适的日粮蛋白水平。目前探讨不同蛋 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
白水平饲料对消化酶的研究中，对于水产类（对虾，罗氏沼虾，宝石鲈）的日粮蛋白水平研究较多，对虾家系的胃蛋白酶活性均随着饲料蛋白含量（蛋白水平范围34-42%）的增加而增加[3]；不同蛋白水平对罗氏沼虾胃蛋白酶比活性影响显著，且随着饲料蛋白水平（蛋白水平范围20.2-51.2%）的上升，胃蛋白酶的比活性也呈上升趋势，表明罗氏沼虾胃蛋白酶活性对饲料中蛋白含量有适应性反应[4]；宝石鲈随着饲料蛋白水平的增加（蛋白水平范围23.64-41.62%），胃蛋白酶活性也增加[5]。但国内外对哺乳类家畜尤其是仔猪的蛋白水平对消化酶的影响研究较少。
仔猪刚断奶后，若没有合理的蛋白水平日粮让其快速适应没有母乳的饲料饲喂，就会使仔猪因为断乳而腹泻，从而导致体重减轻、免疫力下降和死亡率上升[6]。胃部的消化吸收对于整个消化系统来说是非常重要的，胃部含有多种消化酶，能促进饲料进行消化，而胃蛋白酶在其中起到至关重要的作用，同时胃部的胃液和其它消化液的酸度（ph值）是食糜的直接环境。因日粮蛋白水平过高，胃肠消化会有未吸收的蛋白质（粪和尿），这些过量的蛋白质不仅会对仔猪生长发育产生影响，也会造成环境污染，造成资源浪费。本实验拟研究不同蛋白水平日粮对断奶仔猪胃液分泌的影响，为找出提高氮利用的途径提供佐证。
1 材料与方法
1.1 主要仪器用品
胃蛋白酶试剂盒（北京鑫方程生物技术有限公司，批次201310）；酶标仪（芬兰，仪器型号352）；洗板机（芬兰，仪器型号AC8）；微量高速离心机（仪器型号TG16W）；隔水式恒温培养箱（仪器型号：GNP-9080）。
1.2日粮设计
本试验采用玉米－豆粕型日粮，参考NRC（2012）以及理想氨基酸模型，形成断奶仔猪（10-30 kg）的日粮配方。每个阶段设计标准（20%CP）、低(17%CP)、超低(14%CP)3个蛋白水平，同时必需氨基酸（赖、蛋、苏、色）的含量保持一致，从而造成必需氨基酸:非必需氨基酸的差异。研究在满足必需氨基酸需要量和适宜比例的条件下，猪胃蛋白酶酶分泌表观差异的规律。
1.3 试验动物及设计
选取28d断奶，环境适应期7d，杜长大三元杂交仔猪54头（10kg），将仔猪随机分为三组，每组18个头，每个重复1头猪，单栏饲养；三组实验猪分别饲喂标准（20%CP）、低（17%CP）、超低（14%CP）蛋白日粮；预饲期3d，仔猪实验期45d，并分别在第10d、25d、45d每组随机选6头前腔静脉采血，并屠宰采样。
1.4 样品采集
实验正式开始后第10d、25d和45d对试验猪前腔静脉取血屠宰并采集样品。样品包括：胃食糜，-20℃保存；血液样品。
1.5 血清样品的制备与分析
采集血液后，将血液样品在-20℃下静置3-4小时，后以4000rpm/min离心15min，小心将上清液移入灭菌后的Eppendorf管，后立刻将样品送至北京方程生物有限公司使用ELISA方法进行血清蛋白酶原Ⅰ、胃蛋白酶原Ⅱ的测定分析。
ELISA方法操作步骤：
（1）标准品的稀释与加样：标准品按照说明书稀释好五个梯度，各个梯度每孔加样量都为50μl；
（2）加样：分别设空白孔、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
40μl，然后再加待测样品10μl。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀；
（3）温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟；
（4）配液洗涤：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水30（48T的20倍）倍稀释后备用；小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
（5）加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外；
（6）温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟；
（7）洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干；
（8）显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟；
（9）终止：每孔加终止液50μl，终止反应；
（10）测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行；
（11）计算：
以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标 准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
1.6 胃液ph值的测定
将胃食糜样品于-20℃取出，先解冻，涡旋，取样，后以6000rmp/min离心10min。取上清液，室温进行pH测定。
选用与样品液ph值相差不超过2个ph单位的标准溶液校准仪器。从第一个标准溶液中取出两个电极，彻底冲洗，并用滤纸吸干。再浸入第二个标准溶液，其ph值大约与前一个相差3个ph单位。若测定值与第二个标准溶液ph值之差0.1ph值时，就需要检查仪器、电极或标准溶液。当三者均无异常则可测定样品液。
样品液的测定：先用水仔细冲洗两个电极，后用样品液冲洗，将电极浸入水样中，小心摇动或搅拌使其均匀，待读数稳定后逐一记录ph值。
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