副猪嗜血杆菌的pcr检测与流行病学调查
本次试验在2个猪场共200头健康猪进行鼻拭子取样，分别用添加血清和NAD的TSB液体培养基进行培养，然后提取DNA进行PCR检测得到不同日龄健康猪带菌情况并作进一步分析，20日龄仔猪带菌率最高，健康120日龄基本不带菌。对疑似病株通过固体培养基进行培养，分离单菌培养进行药敏试验，抗生素药物敏感试验结果表明，分离菌株对多西环素、头孢唑肟、氟苯尼考、大观霉素、恩诺沙星、红霉素、头孢噻吩高敏; 对丁胺卡那霉素、诺氟沙星、庆大霉素、氧氟沙星中敏；对磺胺类药物耐药。对PCR产物进行胶回收处理，然后通过上海英骏公司测序得到序列和副猪嗜血杆菌匹配度达99%以上。
目录
摘要 2
Abstract 2
引言 2
1、材料和方法 2
1.1、材料 2
1.1.1、病料来源 2
1.1.2、试剂准备 2
1.1.3、培养基配方 3
1.1.4、仪器准备 3
1.2、方法 3
1.2.1、PCR鉴定 3
1.2.2、样品处理方法比较 4
1.2.3、流行病学调查 4
1.2.4、细菌分离培养 4
1.2.5、药敏试验 5
2、结果 5
2.1、两个猪场健康猪各个日龄副猪嗜血杆菌带菌情况 5
2.1.1、江苏金坛某猪场80个样 6
2.1.2、江苏常州某猪场80个样 6
2.1.3、两个猪场各个日龄副猪嗜血杆菌阳性对照比较 7
2.1.4、结论 8
2.2、细菌分类培养结果 8
2.3、序列扩增和分析结果 8
2.3.1、胶回收连接、转化PCR结果 8
2.4、药敏试验结果 9
2.4.1、药敏结果显示如表22 9
3、分析 10
致谢 10
参考文献： 10
副猪嗜血杆菌的PCR检测与流行病学调查
动物医学 谢慕可
引言
副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuls，HPs）是导致猪患格拉斯病（Glas *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
sers Disease）的主要病原菌，它在临床上常引起以关节炎、纤维蛋白性多发性浆膜炎和脑膜炎为特征的全身性疾病。[1]副猪嗜血杆菌是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依赖性的不运动的、细小杆状革兰氏阴性菌。随着我国经济的发展，猪场的规模化扩大使得副猪嗜血杆菌的感染明显增加，这已经成为猪场保育猪和仔猪死亡日益增加的重要原因。[2]鉴于此，对副猪嗜血杆菌的检测与流行病学调查对减少猪业生产损失具有重要的意义。
1、材料和方法
1.1、材料
1.1.1、病料来源：2015年3月12日在江苏金坛某猪场80头健康猪，分别为20日龄、40日龄、60日龄和120日龄各20头，鼻拭子采集；2015年3月24日江苏常州某猪场101头健康猪，分别20日龄，40日龄、60日龄和120日龄，鼻拭子采集。
1.1.2、试剂准备：Tryptone soya broth（TSB，30g/L）、琼脂粉(1.8%)、2*PCR Taq MsterMix 购买于康润生物（Genstar）, DEPC处理水购买于北京索莱宝科技有限公司（Solarbio）,购买于北京索莱宝科技有限公司（Solarbio），新生牛血清购买于上海汇仁医药有限公司，NAD（sigma分装）。NaCl,胰蛋白胨，酵母发酵物，琼脂粉、氨苄
1.1.3、培养基配方：TSB液体培养基[3]—1000ml TSB溶液分装200支（30g TSB粉末加到一定去离子水溶液中再定容到1000ml,121℃高压）。
TSB固体培养基—1600ml分装100个平板(48g TSB粉末和28.8g琼脂粉加到一定去离子水溶液中搅拌均匀再定容到1600ml，121℃高压，降温到常温后添加1.6ml (1‰) NAD,血清80ml (5%))。
LB液体培养基—NaCl(1%),胰蛋白胨（1%），酵母发酵物（0.5%）制成LB液体培养液。[4]69
LB固体培养基—NaCl(1%),胰蛋白胨（1%），酵母发酵物（0.5%），琼脂粉（1.5%）、氨苄（1‰）高压后分装到为固体培养基。
1.1.4、仪器准备：PCR仪（TaKaRa公司，TP600）、离心机5418（艾本德公司，eppendorf）、掌上离心机、恒温箱、摇床、水浴锅等
1.2、方法
1.2.1、PCR鉴定 疑似菌株进行PCR鉴定，其中以参考阳性菌株的DNA模板为阳性对照，添加有等量去离子水的为阴性对照进行PCR鉴定。
（1）引物设计
Invitrogen公司合成的副猪嗜血杆菌PCR 鉴定引物设计[4]68，HPS59，P1：5’GTGATGAGGAAGGGTGGTGT3’;HPS59，P2：5’GGCTTCGTCACCCTCTGT3’预期片段大小为822 bp；D2000的star marker购买于加拿大应用生物材料公司（ABM）。
（2）DNA模板的提取
a)在无菌操作台吸取1ml病料液体培养液到无菌的1.5ml EP管中，标记。
b)将加在EP管中的病料在离心机上12000rpm 5分钟（病料完全沉淀）。
c)去除澄清的上清液（更换枪头处理，避免交叉感染）。
d)在以上EP管中分别加入100μl DEPC处理水重悬，煮沸10min。
e)将加在EP管中的病料在离心机上12000 r/min 1 min。
f)吸取离心完成的EP管中的上清液置于新的EP管中，重新标号。
（3）PCR准备
a)一共80个样，和4个阳性和阴性对照，一共88个样。
b)PCR样品比较多，所以25μl体系进行PCR，用两个EP管分装。
表1 PCR加样体系
2*PCR Taq MsterMix
去离子水
引物
DNA模板
上
下
单个样
12.5μl
8.5μl
1μl
1μl
2μl
90个样
1125μl
765μl
90μl
90μl
c)在PCR管中分别添加23μl以上混合溶液，标记后分别加入2μl不同样本DNA模板。
目录
摘要 2
Abstract 2
引言 2
1、材料和方法 2
1.1、材料 2
1.1.1、病料来源 2
1.1.2、试剂准备 2
1.1.3、培养基配方 3
1.1.4、仪器准备 3
1.2、方法 3
1.2.1、PCR鉴定 3
1.2.2、样品处理方法比较 4
1.2.3、流行病学调查 4
1.2.4、细菌分离培养 4
1.2.5、药敏试验 5
2、结果 5
2.1、两个猪场健康猪各个日龄副猪嗜血杆菌带菌情况 5
2.1.1、江苏金坛某猪场80个样 6
2.1.2、江苏常州某猪场80个样 6
2.1.3、两个猪场各个日龄副猪嗜血杆菌阳性对照比较 7
2.1.4、结论 8
2.2、细菌分类培养结果 8
2.3、序列扩增和分析结果 8
2.3.1、胶回收连接、转化PCR结果 8
2.4、药敏试验结果 9
2.4.1、药敏结果显示如表22 9
3、分析 10
致谢 10
参考文献： 10
副猪嗜血杆菌的PCR检测与流行病学调查
动物医学 谢慕可
引言
副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuls，HPs）是导致猪患格拉斯病（Glas *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
sers Disease）的主要病原菌，它在临床上常引起以关节炎、纤维蛋白性多发性浆膜炎和脑膜炎为特征的全身性疾病。[1]副猪嗜血杆菌是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依赖性的不运动的、细小杆状革兰氏阴性菌。随着我国经济的发展，猪场的规模化扩大使得副猪嗜血杆菌的感染明显增加，这已经成为猪场保育猪和仔猪死亡日益增加的重要原因。[2]鉴于此，对副猪嗜血杆菌的检测与流行病学调查对减少猪业生产损失具有重要的意义。
1、材料和方法
1.1、材料
1.1.1、病料来源：2015年3月12日在江苏金坛某猪场80头健康猪，分别为20日龄、40日龄、60日龄和120日龄各20头，鼻拭子采集；2015年3月24日江苏常州某猪场101头健康猪，分别20日龄，40日龄、60日龄和120日龄，鼻拭子采集。
1.1.2、试剂准备：Tryptone soya broth（TSB，30g/L）、琼脂粉(1.8%)、2*PCR Taq MsterMix 购买于康润生物（Genstar）, DEPC处理水购买于北京索莱宝科技有限公司（Solarbio）,购买于北京索莱宝科技有限公司（Solarbio），新生牛血清购买于上海汇仁医药有限公司，NAD（sigma分装）。NaCl,胰蛋白胨，酵母发酵物，琼脂粉、氨苄
1.1.3、培养基配方：TSB液体培养基[3]—1000ml TSB溶液分装200支（30g TSB粉末加到一定去离子水溶液中再定容到1000ml,121℃高压）。
TSB固体培养基—1600ml分装100个平板(48g TSB粉末和28.8g琼脂粉加到一定去离子水溶液中搅拌均匀再定容到1600ml，121℃高压，降温到常温后添加1.6ml (1‰) NAD,血清80ml (5%))。
LB液体培养基—NaCl(1%),胰蛋白胨（1%），酵母发酵物（0.5%）制成LB液体培养液。[4]69
LB固体培养基—NaCl(1%),胰蛋白胨（1%），酵母发酵物（0.5%），琼脂粉（1.5%）、氨苄（1‰）高压后分装到为固体培养基。
1.1.4、仪器准备：PCR仪（TaKaRa公司，TP600）、离心机5418（艾本德公司，eppendorf）、掌上离心机、恒温箱、摇床、水浴锅等
1.2、方法
1.2.1、PCR鉴定 疑似菌株进行PCR鉴定，其中以参考阳性菌株的DNA模板为阳性对照，添加有等量去离子水的为阴性对照进行PCR鉴定。
（1）引物设计
Invitrogen公司合成的副猪嗜血杆菌PCR 鉴定引物设计[4]68，HPS59，P1：5’GTGATGAGGAAGGGTGGTGT3’;HPS59，P2：5’GGCTTCGTCACCCTCTGT3’预期片段大小为822 bp；D2000的star marker购买于加拿大应用生物材料公司（ABM）。
（2）DNA模板的提取
a)在无菌操作台吸取1ml病料液体培养液到无菌的1.5ml EP管中，标记。
b)将加在EP管中的病料在离心机上12000rpm 5分钟（病料完全沉淀）。
c)去除澄清的上清液（更换枪头处理，避免交叉感染）。
d)在以上EP管中分别加入100μl DEPC处理水重悬，煮沸10min。
e)将加在EP管中的病料在离心机上12000 r/min 1 min。
f)吸取离心完成的EP管中的上清液置于新的EP管中，重新标号。
（3）PCR准备
a)一共80个样，和4个阳性和阴性对照，一共88个样。
b)PCR样品比较多，所以25μl体系进行PCR，用两个EP管分装。
表1 PCR加样体系
2*PCR Taq MsterMix
去离子水
引物
DNA模板
上
下
单个样
12.5μl
8.5μl
1μl
1μl
2μl
90个样
1125μl
765μl
90μl
90μl
c)在PCR管中分别添加23μl以上混合溶液，标记后分别加入2μl不同样本DNA模板。
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