使用shotgun技术研究感染犬瘟热病毒后的vero细胞的蛋白质组表达变化
Vero细胞是一种对许多病毒都较敏感的细胞。本实验使用犬瘟热病毒感染vero细胞，并设置未感染的对照组细胞，对两组细胞样品提取的蛋白质组使用LC-MS/MS的方法进行检测。一共检测到了11359个肽段，由此鉴定出了2808个蛋白（FDR<0.01）。通过筛选后对得到对照组有而感染组无（A组）的蛋白共146个，对照组无而感染组有（B组）的蛋白共43个。 GO 分析结果显示，A组差异表达蛋白的分子功能主要为结合作用和催化活性。KEGG Pathways 分析结果表明差异蛋白主要涉及RNA降解通路、氨基酸生物合成通路、泛素介导的蛋白质降解通路，剪接体通路和细胞骨架肌动蛋白的组装控通路。对照组无而感染组有的蛋白共43个。GO 分析结果显示，B组表达蛋白的分子功能主要为结合作用和催化活性。KEGG Pathways 分析结果表明差异嘧啶代谢通路和胰岛素信号转导通路是最主要的涉及通路。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1犬瘟热病毒感染vero细胞及其阴性对照细胞的培养和构建2
1.2细胞蛋白的提取及定量 2
1.3蛋白质的SDSPAGE试验2
1.4蛋白质的FASP（Filter Aided Sample Preparation）酶解2
1.5 酶解产物的LCMS/MS分析 3
1.6 MASCOT的非标记分析3
1.7 生物信息学分析 3
2. 结果与分析3
2.1感染组和对照组蛋白质的识别和分析 3
2.1.1蛋白质浓度测定（BCA法）4
2.1.2 SDSPAGE分析4
2.1.3 肽段OD280测定 4
2.1.4蛋白质鉴定及定量结果 5
2.2差异蛋白的GO分析6
2.2.1对照组有而感染组无（A组）的蛋白6
2.2.2感染组有而对照组无（B组）的差异蛋白8
2.3 KEGG pathway通路分析 10
2.3.1对照组有而感染组无（A组）的蛋白的KEGG p *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
athway通路分析10
2.3.2感染组有对照组无而（B组）的蛋白的KEGG pathway通路分析15
3. 讨论 16
致谢16
参考文献17
使用shotgun技术研究感染犬瘟热病毒后的vero细胞的蛋白质组表达变化
引言
引言 犬瘟热（Canine distemper,CD）是世界范围内广泛发生的一种病毒性传染病，其病原为犬瘟热病毒（Canine distemper virus,CDV），隶属于副黏病毒科麻疹病毒属，其自然宿主包括大部分的食肉目动物[1]。虽然犬瘟热病毒疫苗对该病毒有较好的预防作用，但是今年来该病的流行性爆发提示其发病机制亦可能存在新的变。CDV的淋巴细胞趋向性和其引起的高度免疫抑制,国内外学者已做了大量研究,但其致病机理及免疫机制至今尚未明确,有待进一步研究。
病毒与宿主细胞蛋白之间复杂的相互作用，是病毒感染的关键，所以一直是病毒学领域研究的热点问题[2]。 国内外已有使用shotgun技术来对病毒感染细胞进行蛋白质组学分析，如禽流感病毒感染的vero细胞等[3]。还有学者使用shotgun技术研究了研究了vero细胞膜蛋白功能，提示了有关病毒入侵的机理[4,5]。说明该方法具有良好的指示性及较成熟的技术路线。鉴于目前CDV感染的严重危害性和国内外研究现状，本研究以CDV易感的 Vero细胞为研究靶标，利用shotgun蛋白质组学技术，通过筛选CDV感染介导 Vero 细胞的差异表达蛋白，进一步进行差异表达蛋白的功能解析，探索CDV 感染相关的蛋白，为CDV发病机理的阐明提供理论基础。
Shotgun技术即为LCMS检测。20世纪80年代后期，两种生物大分子离子化技术电喷雾离子化（ESI）和基质辅助激光解吸附离子化（MALDI）的发明使得质谱技术进入了生物大分子领域，并且成为了蛋白质组学研究的重要手段之一[6]。
质谱技术的基本原理是样品分子离子化之后，根据不同离子间质荷比的差异来分离并确定分子质量。即通过不同方法分离得到的蛋白质经酶切后，先由离子化源将样品分子转化为气态离子，由于不同质荷比离子在电场中运动的轨迹和速度不同，这样通过质量分析器，根据不同质荷比进行分离，最后进入离子检测装置，得到质谱图谱，在此基础对被分析物质进行定量定性分析[7]。
方法和材料
1.1犬瘟热病毒感染vero细胞及其阴性对照细胞的培养和构建
Vero细胞系的来源为ATCC（American Type Culture Collection），储存在液氮中保存在中国农业科学院上海兽医研究所。实验组和对照组的Vero细胞在含有10% fetal bovine serum的DMEM中培养，环境温度为37摄氏度，并且含有5% CO2。犬瘟热种毒为中国农业科学院上海兽医所所保存，为 02L8D12，细胞培养在24h接毒，72h结束培养，零下80摄氏度保存后提取蛋白质。因为发现在72h细胞皱缩，细胞融合等清晰的 CPE，而且细胞结构保持完整。 在实验过程中我们发现，当接种病毒感染时间少于 72 h 时，倒置显微镜下观察细胞并未出现比较明显的 CPE。因此，不能保证 PEDV 在Vero细胞中繁殖。而在病毒接种感染72h 后，虽然出现了CPE，但我们发现细胞结构出现了不同程度的破坏，无法保证细胞的完整性。
1.2细胞蛋白的提取及定量
72h后感染组和位感染组分别提取蛋白。两组取的细胞量均在6×106 左右。倒出或吸出培养皿中的培养液，小心的加入预冷适量的PBS，尽量保持细胞的贴壁状态，轻微晃动后吸出PBS，再次小心加入适量PBS洗涤三次，最后吸出PBS后，加入0.51mlSDT裂解液，使裂解液布满平皿底部。用细胞刮刀将细胞和裂解液刮下，转移至离心管中。水浴煮沸5min后超声破碎（80w，超声10s，间歇15s，共10次），离心取上清，BCA法蛋白质定量。分装后低温保存。
1.3蛋白质的SDSPAGE试验
两个组的样品各取20μg，进行SDSPAGE试验。
1.4蛋白质的FASP（Filter Aided Sample Preparation）酶解
取约100μg各样品，分别加入 DTT至终浓度为100 mM，沸水浴5min，冷却至室温。向所有样品管中加入加入200μL UA buffer（8 M Urea，150 mM TrisHCl pH 8.0）离心14000g 15min，弃滤液。加入100μL IAA（50mM IAA in UA），600rpm振荡1min，避光室温30min，离心14000g 10min。加入100μgL UA buffer，离心14000g 10min重复2次。加入100μL 25mM 碳酸氢铵溶液 ，离心14000g 10min重复2次。加入40μLTrypsin buffer（2μg Trypsin in 25mM碳酸氢铵溶液），600rpm振荡1min ，37℃ 1618h。换新收集管，离心14000g 10min，取滤液，OD280肽段定量。
1.5 酶解产物的LCMS/MS分析
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1犬瘟热病毒感染vero细胞及其阴性对照细胞的培养和构建2
1.2细胞蛋白的提取及定量 2
1.3蛋白质的SDSPAGE试验2
1.4蛋白质的FASP（Filter Aided Sample Preparation）酶解2
1.5 酶解产物的LCMS/MS分析 3
1.6 MASCOT的非标记分析3
1.7 生物信息学分析 3
2. 结果与分析3
2.1感染组和对照组蛋白质的识别和分析 3
2.1.1蛋白质浓度测定（BCA法）4
2.1.2 SDSPAGE分析4
2.1.3 肽段OD280测定 4
2.1.4蛋白质鉴定及定量结果 5
2.2差异蛋白的GO分析6
2.2.1对照组有而感染组无（A组）的蛋白6
2.2.2感染组有而对照组无（B组）的差异蛋白8
2.3 KEGG pathway通路分析 10
2.3.1对照组有而感染组无（A组）的蛋白的KEGG p *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
athway通路分析10
2.3.2感染组有对照组无而（B组）的蛋白的KEGG pathway通路分析15
3. 讨论 16
致谢16
参考文献17
使用shotgun技术研究感染犬瘟热病毒后的vero细胞的蛋白质组表达变化
引言
引言 犬瘟热（Canine distemper,CD）是世界范围内广泛发生的一种病毒性传染病，其病原为犬瘟热病毒（Canine distemper virus,CDV），隶属于副黏病毒科麻疹病毒属，其自然宿主包括大部分的食肉目动物[1]。虽然犬瘟热病毒疫苗对该病毒有较好的预防作用，但是今年来该病的流行性爆发提示其发病机制亦可能存在新的变。CDV的淋巴细胞趋向性和其引起的高度免疫抑制,国内外学者已做了大量研究,但其致病机理及免疫机制至今尚未明确,有待进一步研究。
病毒与宿主细胞蛋白之间复杂的相互作用，是病毒感染的关键，所以一直是病毒学领域研究的热点问题[2]。 国内外已有使用shotgun技术来对病毒感染细胞进行蛋白质组学分析，如禽流感病毒感染的vero细胞等[3]。还有学者使用shotgun技术研究了研究了vero细胞膜蛋白功能，提示了有关病毒入侵的机理[4,5]。说明该方法具有良好的指示性及较成熟的技术路线。鉴于目前CDV感染的严重危害性和国内外研究现状，本研究以CDV易感的 Vero细胞为研究靶标，利用shotgun蛋白质组学技术，通过筛选CDV感染介导 Vero 细胞的差异表达蛋白，进一步进行差异表达蛋白的功能解析，探索CDV 感染相关的蛋白，为CDV发病机理的阐明提供理论基础。
Shotgun技术即为LCMS检测。20世纪80年代后期，两种生物大分子离子化技术电喷雾离子化（ESI）和基质辅助激光解吸附离子化（MALDI）的发明使得质谱技术进入了生物大分子领域，并且成为了蛋白质组学研究的重要手段之一[6]。
质谱技术的基本原理是样品分子离子化之后，根据不同离子间质荷比的差异来分离并确定分子质量。即通过不同方法分离得到的蛋白质经酶切后，先由离子化源将样品分子转化为气态离子，由于不同质荷比离子在电场中运动的轨迹和速度不同，这样通过质量分析器，根据不同质荷比进行分离，最后进入离子检测装置，得到质谱图谱，在此基础对被分析物质进行定量定性分析[7]。
方法和材料
1.1犬瘟热病毒感染vero细胞及其阴性对照细胞的培养和构建
Vero细胞系的来源为ATCC（American Type Culture Collection），储存在液氮中保存在中国农业科学院上海兽医研究所。实验组和对照组的Vero细胞在含有10% fetal bovine serum的DMEM中培养，环境温度为37摄氏度，并且含有5% CO2。犬瘟热种毒为中国农业科学院上海兽医所所保存，为 02L8D12，细胞培养在24h接毒，72h结束培养，零下80摄氏度保存后提取蛋白质。因为发现在72h细胞皱缩，细胞融合等清晰的 CPE，而且细胞结构保持完整。 在实验过程中我们发现，当接种病毒感染时间少于 72 h 时，倒置显微镜下观察细胞并未出现比较明显的 CPE。因此，不能保证 PEDV 在Vero细胞中繁殖。而在病毒接种感染72h 后，虽然出现了CPE，但我们发现细胞结构出现了不同程度的破坏，无法保证细胞的完整性。
1.2细胞蛋白的提取及定量
72h后感染组和位感染组分别提取蛋白。两组取的细胞量均在6×106 左右。倒出或吸出培养皿中的培养液，小心的加入预冷适量的PBS，尽量保持细胞的贴壁状态，轻微晃动后吸出PBS，再次小心加入适量PBS洗涤三次，最后吸出PBS后，加入0.51mlSDT裂解液，使裂解液布满平皿底部。用细胞刮刀将细胞和裂解液刮下，转移至离心管中。水浴煮沸5min后超声破碎（80w，超声10s，间歇15s，共10次），离心取上清，BCA法蛋白质定量。分装后低温保存。
1.3蛋白质的SDSPAGE试验
两个组的样品各取20μg，进行SDSPAGE试验。
1.4蛋白质的FASP（Filter Aided Sample Preparation）酶解
取约100μg各样品，分别加入 DTT至终浓度为100 mM，沸水浴5min，冷却至室温。向所有样品管中加入加入200μL UA buffer（8 M Urea，150 mM TrisHCl pH 8.0）离心14000g 15min，弃滤液。加入100μL IAA（50mM IAA in UA），600rpm振荡1min，避光室温30min，离心14000g 10min。加入100μgL UA buffer，离心14000g 10min重复2次。加入100μL 25mM 碳酸氢铵溶液 ，离心14000g 10min重复2次。加入40μLTrypsin buffer（2μg Trypsin in 25mM碳酸氢铵溶液），600rpm振荡1min ，37℃ 1618h。换新收集管，离心14000g 10min，取滤液，OD280肽段定量。
1.5 酶解产物的LCMS/MS分析
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