斯里兰卡星龟体内香味类香味菌高度同源株的分离与鉴定
本实验旨在从海南某陆龟保育基地内多只患病斯里兰卡星龟体内分离鉴定病原菌，收集了两只濒死斯里兰卡星龟的病料，通过病理解剖、触片镜检、细菌分离培养、16S rRNA扩增测序等方法，基于16S rRNA序列构建系统发育树鉴定细菌种属，鉴定分离菌生理生化特征，进行药敏试验探寻敏感药物。结果自两龟的病料内分离得到六株相互间高度同源的革兰氏阴性杆菌，为同一种属细菌，命名为HN20170921，16S rRNA鉴定结果显示出该菌与Myroides odoratimimus CCUG 39352同源性达99.41 %且在系统进化树上聚为一枝，生理生化特征鉴定结果进一步验证该菌的生理生化特征基本符合香味类香味菌细菌生理生化特征，药敏试验结果显示该分离菌仅对测试的16种抗生素中的磺胺异噁唑敏感。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 材料与仪器 2
1.1.1 病料 2
1.1.2 主要试剂及材料 2
1.2 方法 2
1.2.1 病料解剖，镜检及细菌分离培养 2
1.2.2 16S rRNA鉴定 2
1.2.2.1 DNA提取 2
1.2.2.2 PCR扩增16S rRNA基因片段 3
1.2.2.3 16S rRNA基因序列分析 3
1.2.3 生理生化特征鉴定 3
1.2.4 药敏试验 3
2 结果与分析 3
2.1 解剖病理症状及镜检结果 3
2.2 16S rRNA鉴定结果总结 5
2.3 生理生化鉴定结果讨论 7
2.4 药敏试验结果 7
3 讨论 8
3 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
.1 斯里兰卡星龟 8
3.2 香味类香味菌 9
3.3 16S rRNA鉴定 9
3.4 实验结果分析与讨论 10
致 谢 11
参考文献 11
斯里兰卡星龟体内香味类香味菌高度同源株的分离与鉴定
引言
引言
目录
一些发达国家很早就开始了对陆龟的人工保育，它们的野生动物资源保护法律也较为完善。但在中国，由于星龟种群数量稀少，引种繁琐，价格高昂，以及相关法律条例的约束等原因，国内对于星龟的生理病理研究基本为零，导致了国内对包括星龟在内的陆龟科爬行动物的诊疗水平低下的现状。
2017年9月，海南某陆龟保育基地户外饲养的斯里兰卡星龟相继出现死亡。检测地表温度，每日三次，白天平均最高地表温度35.6 ℃，夜间平均最低地表温度21.2 ℃。无明显临床症状。本文从病龟解剖，触片镜检，细菌分离培养，16S rRNA鉴定，生理生化管特征鉴定等方面进行系统研究，从两只濒死斯里兰卡星龟体内多个脏器均分离出Myroides odoratimimu（香味类香味菌），通过16S rRNA 基因序列分析和生理生化特征鉴定，发现该分离菌与Myroides odoratimimus CCUG 39352同源性达99.41 %。
1 材料与方法
1．1 材料与仪器
1.1.1 病料
海南某陆龟保育基地的两只濒死斯里兰卡星龟。
1.1.2 主要试剂及材料
LB肉汤培养基，LB肉汤琼脂，购自上海生工生物工程股份有限公司；DNA Marker，PCR Mix，购自南京寿德生物科技有限公司；细菌生化鉴定管和药敏纸片，购自杭州天和微生物试剂有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司。
16S rRNA通用引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1492R：ACGGCTACCTTGTTACGACTT，由上海生工生物工程股份有限公司合成。
1．2 方法
1.2.1 病料解剖，镜检及细菌分离培养
于2017年9月21日解剖两只死亡龟，分别编号1#和2#，解剖后观察相应病理变化，无菌取出两龟的心脏、肝脏和肾脏，无菌剪取心脏、肝脏和肾脏进行触片，做革兰氏染色，镜检。严格无菌操作，接种环分别蘸取各脏器切口斜面后，于LB培养基上做三区平板划线，28 ℃恒温培养24 h，分离出单菌落。
挑选典型菌落进一步纯化，对符合预期实验现象的细菌进行试管接种，于LB液体培养基中进行大量扩增。
1.2.2 16S rRNA鉴定
1.2.2.1 DNA提取
采用直接煮沸法提取DNA，取新鲜细菌悬液，置于沸水浴中煮沸10 min。然后使用高速离心机以12000 r/min转速离心10 min，上清液即为细菌DNA溶液，用作PCR扩增的模板。
1.2.2.2 PCR扩增16S rRNA基因片段
选取通用引物27F和1492R作为扩增引物，使用提取出的细菌DNA作为PCR模板，进行细菌16S rRNA 序列的PCR扩增。PCR采用50 μL反应体系:PCR Mix 25 μL，DNA模板 1 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 22 μL。混匀体系各组分，采用Biometra Personal Cycler PCR仪进行PCR反应，反应程序：94 ℃ 预变性 5 min ，1个循环；94 ℃ 变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30个循环；72 ℃延伸7 min，1个循环；4 ℃保存。
1.2.2.3 16S rRNA 基因序列分析
PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测，使用凝胶成像系统观察并记录结果，将含有扩增的目的基因片段的琼脂糖凝胶切下，按照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒操作步骤回收PCR扩增产物。纯化后的PCR扩增产物送由上海生工生物工程股份有限公司进行测序。
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摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 材料与仪器 2
1.1.1 病料 2
1.1.2 主要试剂及材料 2
1.2 方法 2
1.2.1 病料解剖，镜检及细菌分离培养 2
1.2.2 16S rRNA鉴定 2
1.2.2.1 DNA提取 2
1.2.2.2 PCR扩增16S rRNA基因片段 3
1.2.2.3 16S rRNA基因序列分析 3
1.2.3 生理生化特征鉴定 3
1.2.4 药敏试验 3
2 结果与分析 3
2.1 解剖病理症状及镜检结果 3
2.2 16S rRNA鉴定结果总结 5
2.3 生理生化鉴定结果讨论 7
2.4 药敏试验结果 7
3 讨论 8
3 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
.1 斯里兰卡星龟 8
3.2 香味类香味菌 9
3.3 16S rRNA鉴定 9
3.4 实验结果分析与讨论 10
致 谢 11
参考文献 11
斯里兰卡星龟体内香味类香味菌高度同源株的分离与鉴定
引言
引言
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一些发达国家很早就开始了对陆龟的人工保育，它们的野生动物资源保护法律也较为完善。但在中国，由于星龟种群数量稀少，引种繁琐，价格高昂，以及相关法律条例的约束等原因，国内对于星龟的生理病理研究基本为零，导致了国内对包括星龟在内的陆龟科爬行动物的诊疗水平低下的现状。
2017年9月，海南某陆龟保育基地户外饲养的斯里兰卡星龟相继出现死亡。检测地表温度，每日三次，白天平均最高地表温度35.6 ℃，夜间平均最低地表温度21.2 ℃。无明显临床症状。本文从病龟解剖，触片镜检，细菌分离培养，16S rRNA鉴定，生理生化管特征鉴定等方面进行系统研究，从两只濒死斯里兰卡星龟体内多个脏器均分离出Myroides odoratimimu（香味类香味菌），通过16S rRNA 基因序列分析和生理生化特征鉴定，发现该分离菌与Myroides odoratimimus CCUG 39352同源性达99.41 %。
1 材料与方法
1．1 材料与仪器
1.1.1 病料
海南某陆龟保育基地的两只濒死斯里兰卡星龟。
1.1.2 主要试剂及材料
LB肉汤培养基，LB肉汤琼脂，购自上海生工生物工程股份有限公司；DNA Marker，PCR Mix，购自南京寿德生物科技有限公司；细菌生化鉴定管和药敏纸片，购自杭州天和微生物试剂有限公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司。
16S rRNA通用引物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG和1492R：ACGGCTACCTTGTTACGACTT，由上海生工生物工程股份有限公司合成。
1．2 方法
1.2.1 病料解剖，镜检及细菌分离培养
于2017年9月21日解剖两只死亡龟，分别编号1#和2#，解剖后观察相应病理变化，无菌取出两龟的心脏、肝脏和肾脏，无菌剪取心脏、肝脏和肾脏进行触片，做革兰氏染色，镜检。严格无菌操作，接种环分别蘸取各脏器切口斜面后，于LB培养基上做三区平板划线，28 ℃恒温培养24 h，分离出单菌落。
挑选典型菌落进一步纯化，对符合预期实验现象的细菌进行试管接种，于LB液体培养基中进行大量扩增。
1.2.2 16S rRNA鉴定
1.2.2.1 DNA提取
采用直接煮沸法提取DNA，取新鲜细菌悬液，置于沸水浴中煮沸10 min。然后使用高速离心机以12000 r/min转速离心10 min，上清液即为细菌DNA溶液，用作PCR扩增的模板。
1.2.2.2 PCR扩增16S rRNA基因片段
选取通用引物27F和1492R作为扩增引物，使用提取出的细菌DNA作为PCR模板，进行细菌16S rRNA 序列的PCR扩增。PCR采用50 μL反应体系:PCR Mix 25 μL，DNA模板 1 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 22 μL。混匀体系各组分，采用Biometra Personal Cycler PCR仪进行PCR反应，反应程序：94 ℃ 预变性 5 min ，1个循环；94 ℃ 变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，30个循环；72 ℃延伸7 min，1个循环；4 ℃保存。
1.2.2.3 16S rRNA 基因序列分析
PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测，使用凝胶成像系统观察并记录结果，将含有扩增的目的基因片段的琼脂糖凝胶切下，按照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒操作步骤回收PCR扩增产物。纯化后的PCR扩增产物送由上海生工生物工程股份有限公司进行测序。
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