猪肺炎支原体eno蛋白免疫原性分析
：烯醇化酶(Enolase, 2-phospho-D-glycerate hydrolyase)是1934年Lohman和Mayerhof在研究肌肉提取物中磷酸甘油酸向丙酮酸转换的过程中发现的。它既可催化糖酵解过程中2-磷酸-D-甘油酸 (PGA)向磷酸-烯醇式丙酮酸(PEP)的转化, 又可在糖原合成过程中, 催化逆向反应, 即作为磷酸丙酮酸水合酶, 使PEP向PGA转化, 因此烯醇化酶在细胞能量代谢过程中起重要的作用。猪支原体肺炎（MPS,Mycoplasma pneumonise of swine）又称猪喘气病或猪地方性流行性肺炎，它是由猪肺炎支原病原菌体引起的主要症状为咳嗽、气喘等的一种接触性慢性呼吸道传染病。本试验主要是对Mhp的烯醇化酶（Enolase，Eno）蛋白免疫原性的进行研究。先制取Eno蛋白，然后检测Eno蛋白酶促活性，再通过以纯化Eno蛋白作为包被抗原，建立间接ELISA方法，最后再用Eno抗原检测Eno免疫小鼠血清的抗体水平。结果表明实验制取的Eno蛋白具有酶促活性，免疫小鼠后血清内抗体水平显著上升。研究结果为Mhp Eno蛋白抗原性深入研究提供了条件，为猪肺炎支原体的早期诊断、疫苗研究提供参考资料。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言4
1材料4
1.1菌株 4
1.2主要材料与试剂4
1.3试验仪器5
2方法5
2.1重组质粒的诱导表达5
2.2表达产物的SDSPAGE检测5
2.3重组蛋白的纯化5
2. 4 BALB/c小鼠的免疫5
2.5建立间接ELISA抗体检测方法5
2.6Eno抗原检测Eno小鼠抗体水平6
2. 7 Eno蛋白的酶活性分析 6
3结果与分析7
3.1酶促活性分析7
3．2 研究温度对酶活性的影响7
3．2小鼠血清抗体效价8
4讨论9
致谢10
参考文献10
附录10
猪肺炎支原体Eno蛋白免疫原性分析
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
引言
引言：烯醇化酶是一种广泛存在于各种生物的糖代谢酶，其主要催化糖酵解途径中2磷酸D甘油酸向磷酸烯醇式丙酮酸的转化，也参与糖原合成过程中的逆反应，因此该酶在细胞的能量代谢过程中发挥重要作用[1]。绝大多数真核及原核细胞中均存在烯醇化酶，且氨基酸序列高度保守[2]。近年来大量研究证明烯醇化酶不仅是能量代谢的重要酶类，而且作为一种兼职蛋白发挥着多种重要功能[3] 。Chen等在鸡毒支原体上发现烯醇化酶以外向酶的形式存在于支原体细胞表面，并具有一系列生物学和免疫学功能[4]。但有关猪肺炎支原体烯醇化酶蛋白相关功能的研究却尚无文献报道，因此，通过对猪肺炎支原体烯醇化酶基因的扩增、原核表达及免疫原性分析，为进一步了解猪烯醇化酶其他生物学功能奠定了基础[5]。虽然目前已研制出猪肺炎支原体的检验手段，以及研制出了相应疫苗，但由于其机制了解的尚不完善，致使猪支原体肺炎仍难以得到有效控制[6]，其原因是猪肺炎支原体的致病机制研究没有清楚。现在猪肺炎支原体的全基因序列测序工作已经完成，伴随蛋白质组学发展，将会有越来越多的猪肺炎支原体的抗原蛋白被发现。
1 材料
1.1质粒、菌株
大肠杆菌pGEX4T1/Eno/BL21(DE3)，不同Mhp毒株（168株、WX株、NJ株，XLW株）由江苏省农业科学院兽医所猪病防控研究室提供；
1．2 主要材料与试剂
SDS、过硫酸胺、丙烯酰胺、N、N甲叉双丙烯酰胺、考马斯亮蓝R250以及四甲基乙二胺（TEMED）为进口分装；硝酸纤维素膜（NC膜）购自上海生物工程公司；羊抗鼠及羊抗猪IgGHRP、DAB显色试剂盒购自武汉博士德公司，其他试剂均为国产分析纯。IPTG、Hepes、D（+）2磷酸甘油酸(2PGA)、兔肌肉烯醇化酶购自 sigma 公司。；牛血清白蛋白（BSA）；TMB、UHP（购自biosharp公司。96孔酶标板；弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂购自Sigma公司。羊抗鼠IgGHRP，羊抗猪IgGHRP购自武汉博士德公司； NADH (烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)、3磷酸甘油脱氢酶、磷酸丙糖异构酶 (TPI)、FDP2Na购自Sigma公司进口分装产品。MgCl2、TrisHCI、小牛血清 (BSA)。其余常规试剂为国产分析纯试剂。BALB/c小鼠购自扬州大学。
1．3 试验仪器
Thermo scientific SL 16R高速冷冻离心机；PTC100 PCR扩增仪；JS380A自动凝胶图像系统；EPS120稳压稳流电泳仪，电泳槽均购自TIANGEN公司；细胞超声破碎仪；美国博腾仪器有限公司 ELX800 酶标仪（购自美国博腾仪器有限公司）；Nanodrop?2000微量紫外分光光度计；HZQF100 全温振荡培养箱（购自太仓市华美生化仪器厂），脱色摇床（江苏荣华仪器制造有限公司）。
2方法
2.1 重组质粒的诱导表达
挑取单菌落，37℃ 150r/min振荡培养过夜，将培养菌液以2%的比例接种含100 μg/mL氨苄的LB液体培养基，37℃继续快速培养至OD600值在0.61.0时加入IPTG（终浓度为1mM）进行诱导表达5h。同时设未诱导的菌、诱导的空载体菌做阴性对照。
2．2 表达产物的SDSPAGE检测
（1）将收集的菌体9000r/min离心10min，沉淀用pH7.2 PBS Buffer重悬，加5×上样缓冲液，煮沸510min，冷却至室温，高速离心30s，每泳道上样15μL。
（2）电泳：浓缩胶电压80V，当样品进入分离胶后电压提升至120V，待溴酚兰到达底线时，切断电源，停止电泳。
（3）染色：将凝胶从电泳槽上取下后，去掉浓缩胶部分，放入盛有考马斯亮蓝的R250染色液的大平皿中，于脱色摇床上，染色1h。
（4）脱色：将凝胶放入脱色液中，脱色后拍照分析。
2．3重组蛋白的纯化
2. 4 BALB/c小鼠的免疫
将纯化得到Eno蛋白稀释至500μg/mL，等体积与弗氏完全佐剂混合，充分乳化，皮下多点接种46周龄BALB/c小鼠5只，每只接种抗原剂量为100 μg。2周后注射同一剂量弗氏不完全佐剂处理的抗原，以后每2周注射1次抗原，以Eno蛋白作阳性对照，PBS作阴性对照。分别于首免后第2周，第4周，第6周，第8周，第10周采血进行检测。
2. 5建立间接ELISA抗体检测方法
包被：Eno 50μg/ml。37℃1h后4℃过夜。
封闭：甩干包被液，PBST洗涤4次，每次5分钟。分别用5%BSA封闭，100μL/孔，37℃2h。
加一抗：血清以1:10稀释，37℃2h。甩干，PBST洗涤4次，每次5分钟。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言4
1材料4
1.1菌株 4
1.2主要材料与试剂4
1.3试验仪器5
2方法5
2.1重组质粒的诱导表达5
2.2表达产物的SDSPAGE检测5
2.3重组蛋白的纯化5
2. 4 BALB/c小鼠的免疫5
2.5建立间接ELISA抗体检测方法5
2.6Eno抗原检测Eno小鼠抗体水平6
2. 7 Eno蛋白的酶活性分析 6
3结果与分析7
3.1酶促活性分析7
3．2 研究温度对酶活性的影响7
3．2小鼠血清抗体效价8
4讨论9
致谢10
参考文献10
附录10
猪肺炎支原体Eno蛋白免疫原性分析
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
引言
引言：烯醇化酶是一种广泛存在于各种生物的糖代谢酶，其主要催化糖酵解途径中2磷酸D甘油酸向磷酸烯醇式丙酮酸的转化，也参与糖原合成过程中的逆反应，因此该酶在细胞的能量代谢过程中发挥重要作用[1]。绝大多数真核及原核细胞中均存在烯醇化酶，且氨基酸序列高度保守[2]。近年来大量研究证明烯醇化酶不仅是能量代谢的重要酶类，而且作为一种兼职蛋白发挥着多种重要功能[3] 。Chen等在鸡毒支原体上发现烯醇化酶以外向酶的形式存在于支原体细胞表面，并具有一系列生物学和免疫学功能[4]。但有关猪肺炎支原体烯醇化酶蛋白相关功能的研究却尚无文献报道，因此，通过对猪肺炎支原体烯醇化酶基因的扩增、原核表达及免疫原性分析，为进一步了解猪烯醇化酶其他生物学功能奠定了基础[5]。虽然目前已研制出猪肺炎支原体的检验手段，以及研制出了相应疫苗，但由于其机制了解的尚不完善，致使猪支原体肺炎仍难以得到有效控制[6]，其原因是猪肺炎支原体的致病机制研究没有清楚。现在猪肺炎支原体的全基因序列测序工作已经完成，伴随蛋白质组学发展，将会有越来越多的猪肺炎支原体的抗原蛋白被发现。
1 材料
1.1质粒、菌株
大肠杆菌pGEX4T1/Eno/BL21(DE3)，不同Mhp毒株（168株、WX株、NJ株，XLW株）由江苏省农业科学院兽医所猪病防控研究室提供；
1．2 主要材料与试剂
SDS、过硫酸胺、丙烯酰胺、N、N甲叉双丙烯酰胺、考马斯亮蓝R250以及四甲基乙二胺（TEMED）为进口分装；硝酸纤维素膜（NC膜）购自上海生物工程公司；羊抗鼠及羊抗猪IgGHRP、DAB显色试剂盒购自武汉博士德公司，其他试剂均为国产分析纯。IPTG、Hepes、D（+）2磷酸甘油酸(2PGA)、兔肌肉烯醇化酶购自 sigma 公司。；牛血清白蛋白（BSA）；TMB、UHP（购自biosharp公司。96孔酶标板；弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂购自Sigma公司。羊抗鼠IgGHRP，羊抗猪IgGHRP购自武汉博士德公司； NADH (烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)、3磷酸甘油脱氢酶、磷酸丙糖异构酶 (TPI)、FDP2Na购自Sigma公司进口分装产品。MgCl2、TrisHCI、小牛血清 (BSA)。其余常规试剂为国产分析纯试剂。BALB/c小鼠购自扬州大学。
1．3 试验仪器
Thermo scientific SL 16R高速冷冻离心机；PTC100 PCR扩增仪；JS380A自动凝胶图像系统；EPS120稳压稳流电泳仪，电泳槽均购自TIANGEN公司；细胞超声破碎仪；美国博腾仪器有限公司 ELX800 酶标仪（购自美国博腾仪器有限公司）；Nanodrop?2000微量紫外分光光度计；HZQF100 全温振荡培养箱（购自太仓市华美生化仪器厂），脱色摇床（江苏荣华仪器制造有限公司）。
2方法
2.1 重组质粒的诱导表达
挑取单菌落，37℃ 150r/min振荡培养过夜，将培养菌液以2%的比例接种含100 μg/mL氨苄的LB液体培养基，37℃继续快速培养至OD600值在0.61.0时加入IPTG（终浓度为1mM）进行诱导表达5h。同时设未诱导的菌、诱导的空载体菌做阴性对照。
2．2 表达产物的SDSPAGE检测
（1）将收集的菌体9000r/min离心10min，沉淀用pH7.2 PBS Buffer重悬，加5×上样缓冲液，煮沸510min，冷却至室温，高速离心30s，每泳道上样15μL。
（2）电泳：浓缩胶电压80V，当样品进入分离胶后电压提升至120V，待溴酚兰到达底线时，切断电源，停止电泳。
（3）染色：将凝胶从电泳槽上取下后，去掉浓缩胶部分，放入盛有考马斯亮蓝的R250染色液的大平皿中，于脱色摇床上，染色1h。
（4）脱色：将凝胶放入脱色液中，脱色后拍照分析。
2．3重组蛋白的纯化
2. 4 BALB/c小鼠的免疫
将纯化得到Eno蛋白稀释至500μg/mL，等体积与弗氏完全佐剂混合，充分乳化，皮下多点接种46周龄BALB/c小鼠5只，每只接种抗原剂量为100 μg。2周后注射同一剂量弗氏不完全佐剂处理的抗原，以后每2周注射1次抗原，以Eno蛋白作阳性对照，PBS作阴性对照。分别于首免后第2周，第4周，第6周，第8周，第10周采血进行检测。
2. 5建立间接ELISA抗体检测方法
包被：Eno 50μg/ml。37℃1h后4℃过夜。
封闭：甩干包被液，PBST洗涤4次，每次5分钟。分别用5%BSA封闭，100μL/孔，37℃2h。
加一抗：血清以1:10稀释，37℃2h。甩干，PBST洗涤4次，每次5分钟。
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