猪链球菌分离株的药敏分析
：猪链球菌病是由许多不同种类的致病性链球菌引起的人畜共患病。猪链球菌病多年来一直是危害养猪业的主要传染病之一，造成了严重的经济损失，也能引起人类的发病和死亡。本试验对采集自江苏某猪场疑似猪链球菌感染的病猪的分离株进行纯化鉴定，对鉴定结果为猪链球菌阳性的16株分离株进行药敏试验，结果表明这些分离株对头孢唑啉，头孢克洛的药物敏感度最高，可作为临床首选药物。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 试验菌株 2
1.1.2 试剂和培养基 2
1.1.3 主要仪器 2
1.2 方法 2
1.2.1 细菌分离纯化2
1.2.2 细菌鉴定2
1.2.3 药敏试验2
2 结果3
2.1 分离鉴定结果3
2.2 药敏试验结果3
3 讨论5
3.1小结 5
3.2 讨论与分析 6
致谢6
参考文献7
图1 部分分离株的猪链球菌PCR检测电泳图3
图2 分离株的药敏试验抑菌圈3
表1 各分离株的药敏抑菌圈大小4
表2 各分离株对抗菌药物的耐药程度4
表3 分离株对各抗菌药物的耐药率，中介率和高敏率5
猪链球菌分离株的药敏分析
引言
猪链球菌病是由多种致病性链球菌感染引起的世界范围内的一种人畜共患病，该病主要病原为猪链球菌。猪链球菌为革兰氏阳性菌，按荚膜多糖差异，可分为35种血清型（1型34型和1/2型），常见致病菌为1，2，7，9型猪链球菌[1]。发生猪链球菌感染后，可引发猪的脑膜炎、急性败血症、心内膜炎、肺炎、关节炎等疾病，对猪场造成极大的经济损失。临床治疗时，首先选择猪链球菌敏感的抗菌药物，如青霉素、阿莫西林等。然而由于抗菌药物在治疗过程中的不合理使用，猪链球菌的耐药性逐渐提高[23]，常常造成常用抗菌药物对猪链球菌病的治疗效果不良，甚至出现无效治疗的情况。本实验对从
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
江苏省某地某猪场疑似猪链球菌感染猪采集病料进行分离，纯化，鉴定，对确认为猪链球菌的分离株进行药敏试验，分析比较这些菌株对于各抗菌药物的耐药性，以期对于未来猪链球菌病的防治研究工作能起到一定的参考作用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验菌株
试验菌株来源于江苏某地某猪场，采集猪场疑似猪链球菌感染猪的淋巴结、肺、脾、脑和关节液等病变组织，分离培养后得到菌株。
1.1.2 试剂和培养基
抗菌药物药敏纸片，制造公司为杭州天和微生物试剂有限公司。THB培养基试管、THB平板等，按照常规配制方法自行配制。5%脱纤绵羊血平板，为加5%脱纤绵羊血的MuellerHinton agar，平板的pH要求在7.27.4之间。
1.1.3 主要仪器
离心机、超净工作台、恒温培养箱、恒温 CO2培养箱、恒温振荡箱、普通PCR仪、核酸电泳仪、4 ℃冰箱等，为实验室常用仪器。
1.2 方法
1.2.1 细菌分离纯化
将采集到的病料以接菌环划线接种于THB平板，于37℃温箱培养24 h后，取出观察平板上菌落形态，挑取平板上疑似猪链球菌的单菌落数个至THB培养基试管，37 ℃恒温摇床培养以达到纯化目的。
1.2.2 细菌鉴定
将分离纯化得到的菌株菌液使用猪链球菌鉴定引物进行PCR鉴定，电泳结果阳性者，即为猪链球菌[4]。对阳性结果菌株以同样方法作再鉴定确认。
PCR鉴定所用引物为猪链球菌的谷氨酸脱氢酶基因GDH。上游引物：GCAGGTATTCTGTCAAACG；下游引物：CCATGGACAGATAAAGATGG。
PCR反应体系为25 μL体系，普通PCR mix12.5 μL，H2O 8 μL，上下游引物各1 μL，细菌DNA2.5 μL。反应条件为94℃预变性5 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环；最后72℃延伸10 min[5]。取10 μL扩增产物在1.0%的琼脂凝胶中进行电泳。目的片段大小为657bp。
1.2.3 药敏试验
采用纸片扩散法。将得到纯化的菌株接种至THB培养基试管，37℃恒温摇床培养一定时间后，测量此时试管菌液的细菌OD值，再以无菌生理盐水将菌液稀释至浓度约1×108 CFU/mL。在超净台中，用微量移液器吸取200 mL细菌菌液至5%脱纤绵羊血平板，再用经酒精灯火焰灭菌后冷却的柺棒将菌液均匀涂布到平皿培养基上。将于酒精灯火焰灭菌后冷却的镊子，从瓶中取药敏片贴到平板培养基表面。然后用镊子轻轻按住药敏片中心，使药敏片更好地与培养基紧紧贴合。药敏片必须等距离地分布于平皿培养基上，一片在平皿正中央，以正中央为圆心等半径地贴其他四片，以保证结果的准确性。每种药敏片给予编号，记下编号所对应的药敏片名称。放好药敏纸片后，在15 min内倒置平板。将所有贴有药敏片的平板培养基置于37℃ CO2温箱中培养，24 h后取出观察效果，测量抑菌圈大小(包括药敏药片直径)。药敏纸片中的抗菌药物成分在平板琼脂中产生扩散，随着距离的增加，抗菌药物的浓度呈现对数减少现象，以药敏纸片为中心形成药物浓度梯度[6]。因此，药敏纸片周围菌株因处于抑菌浓度范围内而无法生长，不在此抑菌范围内的菌株则不受影响继续生长，呈现在平板上则可见药敏纸片的周围形成一圈无菌生长的抑菌圈，不同的抗菌药物的抑菌圈直径大小主要受该药物在琼脂中扩散速度影响，扩散速度越快，则抑菌圈越大。抑菌圈的大小表示对该抗菌药物的敏感程度。根据药敏纸片出产公司提供的抑菌范围解释标准判定猪链球菌各分离株对各抗菌药物的敏感性。
2 结果
2.1 分离鉴定结果
将采集病料接种于THB平板培养，取出后，可见白色、透明、表面光滑、边沿整齐、直径约为0.5 mm0.75 mm的菌落。挑取数个单菌落至THB培养基试管培养，而后用试剂盒对各分离株进行细菌DNA的提取[78]。再以猪链球菌鉴定引物对各分离株提取到的细菌DNA进行PCR鉴定，重复两次鉴定过程，根据两次电泳结果来筛选出确认为猪链球菌的分离株，剔除非猪链球菌或鉴定结果存疑的分离株，以保证试验结果的准确性。
2.2 药敏试验结果
猪链球菌分离株的5%脱纤绵羊血平板药敏试验抑菌圈示意图见图2。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 试验菌株 2
1.1.2 试剂和培养基 2
1.1.3 主要仪器 2
1.2 方法 2
1.2.1 细菌分离纯化2
1.2.2 细菌鉴定2
1.2.3 药敏试验2
2 结果3
2.1 分离鉴定结果3
2.2 药敏试验结果3
3 讨论5
3.1小结 5
3.2 讨论与分析 6
致谢6
参考文献7
图1 部分分离株的猪链球菌PCR检测电泳图3
图2 分离株的药敏试验抑菌圈3
表1 各分离株的药敏抑菌圈大小4
表2 各分离株对抗菌药物的耐药程度4
表3 分离株对各抗菌药物的耐药率，中介率和高敏率5
猪链球菌分离株的药敏分析
引言
猪链球菌病是由多种致病性链球菌感染引起的世界范围内的一种人畜共患病，该病主要病原为猪链球菌。猪链球菌为革兰氏阳性菌，按荚膜多糖差异，可分为35种血清型（1型34型和1/2型），常见致病菌为1，2，7，9型猪链球菌[1]。发生猪链球菌感染后，可引发猪的脑膜炎、急性败血症、心内膜炎、肺炎、关节炎等疾病，对猪场造成极大的经济损失。临床治疗时，首先选择猪链球菌敏感的抗菌药物，如青霉素、阿莫西林等。然而由于抗菌药物在治疗过程中的不合理使用，猪链球菌的耐药性逐渐提高[23]，常常造成常用抗菌药物对猪链球菌病的治疗效果不良，甚至出现无效治疗的情况。本实验对从
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
江苏省某地某猪场疑似猪链球菌感染猪采集病料进行分离，纯化，鉴定，对确认为猪链球菌的分离株进行药敏试验，分析比较这些菌株对于各抗菌药物的耐药性，以期对于未来猪链球菌病的防治研究工作能起到一定的参考作用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验菌株
试验菌株来源于江苏某地某猪场，采集猪场疑似猪链球菌感染猪的淋巴结、肺、脾、脑和关节液等病变组织，分离培养后得到菌株。
1.1.2 试剂和培养基
抗菌药物药敏纸片，制造公司为杭州天和微生物试剂有限公司。THB培养基试管、THB平板等，按照常规配制方法自行配制。5%脱纤绵羊血平板，为加5%脱纤绵羊血的MuellerHinton agar，平板的pH要求在7.27.4之间。
1.1.3 主要仪器
离心机、超净工作台、恒温培养箱、恒温 CO2培养箱、恒温振荡箱、普通PCR仪、核酸电泳仪、4 ℃冰箱等，为实验室常用仪器。
1.2 方法
1.2.1 细菌分离纯化
将采集到的病料以接菌环划线接种于THB平板，于37℃温箱培养24 h后，取出观察平板上菌落形态，挑取平板上疑似猪链球菌的单菌落数个至THB培养基试管，37 ℃恒温摇床培养以达到纯化目的。
1.2.2 细菌鉴定
将分离纯化得到的菌株菌液使用猪链球菌鉴定引物进行PCR鉴定，电泳结果阳性者，即为猪链球菌[4]。对阳性结果菌株以同样方法作再鉴定确认。
PCR鉴定所用引物为猪链球菌的谷氨酸脱氢酶基因GDH。上游引物：GCAGGTATTCTGTCAAACG；下游引物：CCATGGACAGATAAAGATGG。
PCR反应体系为25 μL体系，普通PCR mix12.5 μL，H2O 8 μL，上下游引物各1 μL，细菌DNA2.5 μL。反应条件为94℃预变性5 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环；最后72℃延伸10 min[5]。取10 μL扩增产物在1.0%的琼脂凝胶中进行电泳。目的片段大小为657bp。
1.2.3 药敏试验
采用纸片扩散法。将得到纯化的菌株接种至THB培养基试管，37℃恒温摇床培养一定时间后，测量此时试管菌液的细菌OD值，再以无菌生理盐水将菌液稀释至浓度约1×108 CFU/mL。在超净台中，用微量移液器吸取200 mL细菌菌液至5%脱纤绵羊血平板，再用经酒精灯火焰灭菌后冷却的柺棒将菌液均匀涂布到平皿培养基上。将于酒精灯火焰灭菌后冷却的镊子，从瓶中取药敏片贴到平板培养基表面。然后用镊子轻轻按住药敏片中心，使药敏片更好地与培养基紧紧贴合。药敏片必须等距离地分布于平皿培养基上，一片在平皿正中央，以正中央为圆心等半径地贴其他四片，以保证结果的准确性。每种药敏片给予编号，记下编号所对应的药敏片名称。放好药敏纸片后，在15 min内倒置平板。将所有贴有药敏片的平板培养基置于37℃ CO2温箱中培养，24 h后取出观察效果，测量抑菌圈大小(包括药敏药片直径)。药敏纸片中的抗菌药物成分在平板琼脂中产生扩散，随着距离的增加，抗菌药物的浓度呈现对数减少现象，以药敏纸片为中心形成药物浓度梯度[6]。因此，药敏纸片周围菌株因处于抑菌浓度范围内而无法生长，不在此抑菌范围内的菌株则不受影响继续生长，呈现在平板上则可见药敏纸片的周围形成一圈无菌生长的抑菌圈，不同的抗菌药物的抑菌圈直径大小主要受该药物在琼脂中扩散速度影响，扩散速度越快，则抑菌圈越大。抑菌圈的大小表示对该抗菌药物的敏感程度。根据药敏纸片出产公司提供的抑菌范围解释标准判定猪链球菌各分离株对各抗菌药物的敏感性。
2 结果
2.1 分离鉴定结果
将采集病料接种于THB平板培养，取出后，可见白色、透明、表面光滑、边沿整齐、直径约为0.5 mm0.75 mm的菌落。挑取数个单菌落至THB培养基试管培养，而后用试剂盒对各分离株进行细菌DNA的提取[78]。再以猪链球菌鉴定引物对各分离株提取到的细菌DNA进行PCR鉴定，重复两次鉴定过程，根据两次电泳结果来筛选出确认为猪链球菌的分离株，剔除非猪链球菌或鉴定结果存疑的分离株，以保证试验结果的准确性。
2.2 药敏试验结果
猪链球菌分离株的5%脱纤绵羊血平板药敏试验抑菌圈示意图见图2。
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