猪源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及药敏试验
：多杀性巴氏杆菌是临床常见的革兰氏阴性病原菌，可以引起多种以败血症和出血性炎症为主要特征的急性、热性禽畜传染疾病，其中猪源多杀性巴氏杆菌引起的猪肺疫和产毒素性多杀性巴氏杆菌引起的猪传染性萎缩性鼻炎给养猪业造成巨大损失。从猪巴氏杆菌病临床病料中分离纯化可疑菌，使用扩增片段长度为457bp的多杀性巴氏杆菌特异性引物进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，观察到目的条带的确定为多杀性巴氏杆菌。对鉴定出的9株猪源多杀性巴氏杆菌进行生化试验和药敏试验。生化试验结果显示分离菌分解葡萄糖、果糖，不分解麦芽糖，产生鸟氨酸脱氢酶，不产生尿素酶，对蔗糖、甘露醇和山梨醇的发酵能力不同菌株间差异较大，与PCR鉴定结果相符。药敏试验结果显示分离菌对恩诺沙星、阿莫西林、青霉素G和头孢噻肟敏感，对其他常见药物的耐药性增强，高敏菌株比例显著下降。说明临床用药与细菌耐药性直接相关，应慎用高敏药物。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 菌株来源2
1.1.2 主要试剂和仪器2
1.1.3 引物设计2
1.2 方法2
1.2.1 细菌分离纯化2
1.2.2 PCR鉴定2
1.2.3 生化鉴定3
1.2.4 药敏试验3
2 结果与分析3
2.1 细菌分离纯化3
2.1.1 镜检结果3
2.1.1 细菌分离培养特性3
2.2 PCR鉴定4
2.3 生化鉴定4
2.4 药敏试验4
3 讨论 5
3.1猪巴氏杆菌病的危害5
3.1.1 猪肺疫5
3.1.2 猪传染性萎缩性鼻炎5
3.2猪多杀性巴氏杆菌病的临床防治6
3.3 Pm的药敏试验6
3.4 Pm的分子生物学鉴定6
3.5 Pm的毒力因子和疫苗研究6
致谢8
参考文献8
图1 疑似Pm的染色镜检结果3
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
图2 疑似Pm的TSA培养结果4
图3 Pm的PCR扩增结果4
表1 9株Pm生化试验结果4
表2 9株Pm药敏试验结果5
猪源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及药敏试验
引言
多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida, Pm)属于巴氏杆菌科(Pasteurellaceae)巴氏杆菌属(Pasteurella)，是引起多种畜禽巴氏杆菌病(pasteurellosis)的病原体，主要引起动物发生出血性败血病或传染性肺炎[1]。感染猪时主要致猪肺疫(Pneumonic Pasteurellosis)和猪传染性萎缩性鼻炎(Swine infectious atrophic rhinitis, AR)。养猪生产中对猪多杀性巴氏杆菌病的诊断主要结合病史，流行病学调查，临床体征症状和剖检变化的观察，从表现出鼻部病变的患猪的鼻腔分泌物以及肺脏等病变组织中对病原菌进行分离和鉴定。由于Pm有多种血清型，并且各血清型之间多数无交叉免疫原性，预防接种主要使用针对当地常见的血清型选用来自同种动物的相同血清型菌株制成的疫苗[2]，临床治疗主要以鉴定Pm后进行的药敏试验为参考，选择敏感药物进行治疗。
本实验所用的九株多杀性巴氏杆菌是通过微生物诊断及分子生物学诊断从近期送检的临床病料中分离纯化得到，对其进行生化试验和药敏试验，为防控猪多杀性巴氏杆菌病提供理论依据。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 菌株来源
从山东、江苏的猪场在2015年9月至11月送检的病料中分离得到九株多杀性巴氏杆菌这些病料主要为患有传染性萎缩性鼻炎猪只的鼻腔棉拭子以及患有肺疫病猪只的肺、脾等组织。
1．1．2 主要试剂和仪器
Pm固体培养基：胰蛋白胨大豆琼脂(Tryptone Soya Agar, TSA)40g溶于1000mL去离子水，高温灭菌后分装平板备用。
Pm液体培养基：胰蛋白胨大豆肉汤(Tryptone Soya Broth,TSB)30g溶于1000mL去离子水，高温灭菌后分装试管备用。
TSA和TSB均购自英国Oxoid公司。PCR扩增仪购自德国Eppendorf公司。紫外凝胶成像系统购自美国UVP有限责任公司。2xTaq PCR Master Mix和DL2000 DNA Marker购自宝生物(TaKaRa)工程（大连）有限公司。细菌微量生化反应管和抗菌药物药敏纸片购自杭州天和微生物试剂公司。
1．1．3 引物设计
参照文献资料[3]根据Pm的16S sRNA基因的序列保守区设计一对扩增片段长度为457bp的Pm通用引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，由大学传染病实验室保存。
P1:5′ATCCGCTATTTACCCAGTGG3′
P2:5′GCTGTAAACGAACTCGCCAC3′
1．2 方法
1．2．1 细菌分离纯化
从送检病料中无菌操作取样，划线接种于TSA平板，置于37℃温箱培养12~18h，观察细菌的生长情况和菌落特征，选择菌落大小为1~2mm左右，表面光滑、湿润，呈灰白色、发蓝色荧光的可疑菌落。挑取上述菌落，在玻片上的2.5μL PBS中涂匀固定后，革兰氏染色并在显微镜下观察。两极染色的革兰氏阴性小杆菌为可疑菌落，挑取可疑菌落接种麦康凯平板和加入100μL血清的TSB培养基中，37℃摇床过夜培养至云雾状。取TSB菌液抹片再次染色镜检，在TSA平板中划线接种菌液，再挑取纯化后的疑似菌落，接种加入100μL血清的TSB培养基中，37℃摇床过夜培养至云雾状，达到纯化菌落的目的。
感染情况复杂、直接分离难度较高的病料如鼻拭子转运液，选择健康小鼠若干分为实验组和空白对照，实验组每只腹腔注射0.5mL鼻拭子转运液，空白组每只注射0.5mL生理盐水后持续观察一周，解剖死亡小鼠，从肝为病料重复上述分离纯化过程。
1．2．2 PCR鉴定
1. 2. 2. 1 PCR模板
取纯化后的TSB菌液1μL为PCR模板。
1. 2. 2. 2 PCR扩增体系
25μL体系中：2xTaq PCR Master Mix 12.5μL，ddH2O 10.5μL，上下游引物各0.5μL，模板1μL。
2. 2. 3 PCR扩增条件
根据文献资料[4]确定PCR扩增的条件：94℃预变性4min后，进入30个循环：94℃30sec、56℃30sec、72℃40sec，最后72℃延伸10min。PCR产物4℃短时间保存。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 菌株来源2
1.1.2 主要试剂和仪器2
1.1.3 引物设计2
1.2 方法2
1.2.1 细菌分离纯化2
1.2.2 PCR鉴定2
1.2.3 生化鉴定3
1.2.4 药敏试验3
2 结果与分析3
2.1 细菌分离纯化3
2.1.1 镜检结果3
2.1.1 细菌分离培养特性3
2.2 PCR鉴定4
2.3 生化鉴定4
2.4 药敏试验4
3 讨论 5
3.1猪巴氏杆菌病的危害5
3.1.1 猪肺疫5
3.1.2 猪传染性萎缩性鼻炎5
3.2猪多杀性巴氏杆菌病的临床防治6
3.3 Pm的药敏试验6
3.4 Pm的分子生物学鉴定6
3.5 Pm的毒力因子和疫苗研究6
致谢8
参考文献8
图1 疑似Pm的染色镜检结果3
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
图2 疑似Pm的TSA培养结果4
图3 Pm的PCR扩增结果4
表1 9株Pm生化试验结果4
表2 9株Pm药敏试验结果5
猪源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及药敏试验
引言
多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida, Pm)属于巴氏杆菌科(Pasteurellaceae)巴氏杆菌属(Pasteurella)，是引起多种畜禽巴氏杆菌病(pasteurellosis)的病原体，主要引起动物发生出血性败血病或传染性肺炎[1]。感染猪时主要致猪肺疫(Pneumonic Pasteurellosis)和猪传染性萎缩性鼻炎(Swine infectious atrophic rhinitis, AR)。养猪生产中对猪多杀性巴氏杆菌病的诊断主要结合病史，流行病学调查，临床体征症状和剖检变化的观察，从表现出鼻部病变的患猪的鼻腔分泌物以及肺脏等病变组织中对病原菌进行分离和鉴定。由于Pm有多种血清型，并且各血清型之间多数无交叉免疫原性，预防接种主要使用针对当地常见的血清型选用来自同种动物的相同血清型菌株制成的疫苗[2]，临床治疗主要以鉴定Pm后进行的药敏试验为参考，选择敏感药物进行治疗。
本实验所用的九株多杀性巴氏杆菌是通过微生物诊断及分子生物学诊断从近期送检的临床病料中分离纯化得到，对其进行生化试验和药敏试验，为防控猪多杀性巴氏杆菌病提供理论依据。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 菌株来源
从山东、江苏的猪场在2015年9月至11月送检的病料中分离得到九株多杀性巴氏杆菌这些病料主要为患有传染性萎缩性鼻炎猪只的鼻腔棉拭子以及患有肺疫病猪只的肺、脾等组织。
1．1．2 主要试剂和仪器
Pm固体培养基：胰蛋白胨大豆琼脂(Tryptone Soya Agar, TSA)40g溶于1000mL去离子水，高温灭菌后分装平板备用。
Pm液体培养基：胰蛋白胨大豆肉汤(Tryptone Soya Broth,TSB)30g溶于1000mL去离子水，高温灭菌后分装试管备用。
TSA和TSB均购自英国Oxoid公司。PCR扩增仪购自德国Eppendorf公司。紫外凝胶成像系统购自美国UVP有限责任公司。2xTaq PCR Master Mix和DL2000 DNA Marker购自宝生物(TaKaRa)工程（大连）有限公司。细菌微量生化反应管和抗菌药物药敏纸片购自杭州天和微生物试剂公司。
1．1．3 引物设计
参照文献资料[3]根据Pm的16S sRNA基因的序列保守区设计一对扩增片段长度为457bp的Pm通用引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，由大学传染病实验室保存。
P1:5′ATCCGCTATTTACCCAGTGG3′
P2:5′GCTGTAAACGAACTCGCCAC3′
1．2 方法
1．2．1 细菌分离纯化
从送检病料中无菌操作取样，划线接种于TSA平板，置于37℃温箱培养12~18h，观察细菌的生长情况和菌落特征，选择菌落大小为1~2mm左右，表面光滑、湿润，呈灰白色、发蓝色荧光的可疑菌落。挑取上述菌落，在玻片上的2.5μL PBS中涂匀固定后，革兰氏染色并在显微镜下观察。两极染色的革兰氏阴性小杆菌为可疑菌落，挑取可疑菌落接种麦康凯平板和加入100μL血清的TSB培养基中，37℃摇床过夜培养至云雾状。取TSB菌液抹片再次染色镜检，在TSA平板中划线接种菌液，再挑取纯化后的疑似菌落，接种加入100μL血清的TSB培养基中，37℃摇床过夜培养至云雾状，达到纯化菌落的目的。
感染情况复杂、直接分离难度较高的病料如鼻拭子转运液，选择健康小鼠若干分为实验组和空白对照，实验组每只腹腔注射0.5mL鼻拭子转运液，空白组每只注射0.5mL生理盐水后持续观察一周，解剖死亡小鼠，从肝为病料重复上述分离纯化过程。
1．2．2 PCR鉴定
1. 2. 2. 1 PCR模板
取纯化后的TSB菌液1μL为PCR模板。
1. 2. 2. 2 PCR扩增体系
25μL体系中：2xTaq PCR Master Mix 12.5μL，ddH2O 10.5μL，上下游引物各0.5μL，模板1μL。
2. 2. 3 PCR扩增条件
根据文献资料[4]确定PCR扩增的条件：94℃预变性4min后，进入30个循环：94℃30sec、56℃30sec、72℃40sec，最后72℃延伸10min。PCR产物4℃短时间保存。
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