猪耐粗饲相关肠道微生物特征初步解析
粗纤维在猪生产上有重要作用，能为猪提供能量、改善动物福利、促进机体健康以及提高母猪繁殖性能。研究猪耐粗饲特性可为猪生产开发新型饲料资源，在一定程度上缓解人猪争粮矛盾，降低饲料成本。猪肠道内的纤维降解主要来自微生物的发酵，因此，肠道内纤维降解微生物的研究就成为近年来解析地方猪耐粗饲机制的一个研究热点和重要方向。苏淮猪是我国自主培育的具有耐粗特性的新品种，为解析其耐粗的肠道微生物机制，本试验比较了7月龄、8月龄苏淮猪的NDF、ADF的表观消化率后，选择7月龄和8月龄NDF消化率最高和最低的5头猪，对结肠和盲肠内容物分解纤维菌进行real-time PCR，比较了高、低纤维消化率苏淮猪结肠、盲肠内白化瘤胃球菌和柔嫩梭菌的丰度差异。结果表明8月龄苏淮猪的NDF、ADF表观消化率均显著高于7月龄(P<0.05)；7月龄苏淮猪结肠内白化瘤胃球菌丰度显著高于盲肠(P<0.05)。低消化率组中，结肠内柔嫩梭菌丰度极显著高于盲肠（P<0.01）；8月龄苏淮猪结肠和盲肠内白化瘤胃球菌柔嫩梭菌丰度和差异均不显著；7、8月龄苏淮猪结肠、盲肠内容物内白化瘤胃球菌和柔嫩梭菌的丰度在高、低纤维消化率组间均无显著差异。关键词纤维分解菌; 耐粗饲; real-time PCR; 苏淮猪Preliminary analysis of the characteristics of intestinal microflora related to roughage feed in Suhuai pigs Student majoring in Animal Science Yongxiang Yang Tutor Ruihua HuangAbstractCrude fiber plays an important role in pig production, providing energy for pigs, improving animal welfare, promoting animal health and improving reproductive performance of sows. Study on the characteristics of pig roughage tolerance can be used to produce new feed resou *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
rces for pig production, and to some extent alleviate the contradiction between human and pig for grain and reduce feed cost. The fermentation of fiber degradation in intestinal tract of swine mainly from microorganisms, intestinal microbial degradation of fiber has become a research hotspot and an important aspect in the analysis of local pig crude feed tolerance mechanism. Suhuai pig is our self cultivation of new varieties with resistance of crude properties, for its resistance to intestinal microbial mechanism analysis crude, this experiment compared 7 and 8 months of age in Suhuai pigs NDF, apparent digestibility of ADF, July and August were age NDF digestibility of the highest and lowest 5 pigs, the colon and cecum of cellulolytic bacterium by real-time PCR. The difference of digestibility between high and low fiber digestibility, colon and caecum, albino, rumen coccus and Clostridium difficile was studied. The results showed that: NDF, apparent digestibility of ADF of Suhuai pigs in the age of 8 months were significantly higher than that of that of those in the age of 7 months (P<0.05); Albino Ruminococcus abundance in the colon was significantly higher than that in the cecum (P<0.05). For low digestibility group, Clostridium leptum abundance in the colon was significantly higher than that in the caecal (P<0.01). Diferrences of the abundance and the differences of old albino Ruminococcus Clostridium leptum between the colon and cecum of Suhuai pigs in the age of 8 months were not significant. The abundance of albino Ruminococcus and Clostridium leptum in the content of colon and cecum of Suhuai pig in the age of 7 and 8 months were not significant difference between the high and low fiber digestibility group. 伴随着我国人口数目增长、城镇化比重上升、居民生活水平不断提高，以及农产品的工业及能源用途拓展，近年以来我国粮食消费量呈明显的逐年增长趋势。但是我国耕地面积在不断的减少。而且最近几年人民对于猪肉的需求量逐渐加大，因此需要更多的土地资源和饲料来保障猪肉的供应，进而导致“人猪争粮争地”尴尬局面。因此提高饲料利用率和粗纤维消化率显得尤为重要。相对于外国猪种,我国地方猪种对粗纤维含量较高的粗饲料利用率高,耐粗饲能力较强，对粗饲料日粮利用和转化率高，增重明显[1]。张斌、胡建新[2]得出豫南黑猪耐粗饲能力较强，对粗饲料日粮利用和转化率高，增重相对明显优于长白和大约克(P<0.05)。秦顺涛，罗荣壮[3]发现陆川猪也有相对于外国猪种具有很强的耐粗饲能力。张秀萍[4]对荷包猪研究中，发现荷包猪能在极低的营养水平下正常生产，可以大量利用青粗饲料和农副产品下脚料，减少蛋白质饲料的给量，节约饲料资源,进而证明荷包猪具有良好的耐粗饲性能。Kemp等对梅山猪与荷兰长白猪饲喂粗纤维日粮，结果发现梅山猪的日粮粗纤维消化率明显高于长白猪[5]。我国地方品种猪耐粗饲的特性，必然少不了纤维分解菌发挥的作用。猪胃和小肠不能产生降解日粮纤维的酶，消化吸收粗纤维主要通过其大肠中微生物如黄化瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens）、白化瘤胃球菌（Ruminococcus albus）和产琥珀酸丝状杆菌（Fibrobacter succinogenes）、柔嫩梭菌（Clostridium Leptum）等的降解作用来实现[6]。令人意外的是从猪胃肠道分离出来纤维降解活性最强的是草食梭状芽孢杆菌（Clostridium herbivorans）[7]。在猪粪便微生物中也是主导菌群，在猪胃肠道中数量也很高（107个/g食糜），等同于甚至高于瘤胃纤维降解菌。而与之研究我国地方猪种梅山猪体内也被分离出过这种纤维分解菌。苏淮猪是新近培育成功的瘦肉型猪种，利用西方生长速度快、瘦肉率高、对精粮依赖度高的大型约克夏与我国淮安地区生长速度慢、肥胖型、耐粗饲的本地品种淮猪杂交选育的新品种，具有25%的淮猪血统。虽然它保留了淮猪耐粗饲特性，但其耐粗饲的具体机制尚不清楚，推测与其大肠纤维分解菌有关。本试验开展中国地方培育猪种苏淮猪的研究，通过对相同生理阶段的苏淮猪肠道内容物纤维表观消化率的测定，利用荧光定量PCR技术，研究高、低纤维消化率苏淮猪各10头，对其结肠和盲肠内容物内常见纤维分解菌柔嫩梭菌和黄化瘤胃球菌的丰度进行测定，为探究苏淮猪耐粗饲机制提供理论支持，并为培育耐粗饲新猪种提供理论依据。1 材料与方法1.1 试验设计选取出生条件相近的苏淮猪育肥猪。在相同饲养环境下进行饲养，保证健康的前提下,在7月龄和8月龄时进行屠宰，采集肠道内容物消化率样品，用10%稀硫酸进行混合处理，测定肠道内容物的NDF表观消化率，采集结肠和盲肠内容物微生物样品，从中分别选取7月龄及8月龄高、低纤维消化率组各5头提取结肠和盲肠内微生物DNA进行Real-time qPCR试验。饲养试验在淮安市淮阴种猪场进行。饲料中均未添加抗生素等。1.2 日粮及饲养管理，试验在江苏省淮安市淮阴种猪场内，在同栋猪舍、相同饲养条件下进行。试验苏淮猪每日饲喂2次，时间分别为上午8:30-9:30和下午14:30-15:30。试验过程采用干料喂养，饲喂时间段自由采食，全天自由饮水，日常管理与防疫按照淮阴种猪场内生产常规执行。1.3样品采集饲养实验结束后，空腹四小时全部屠宰。禁食12小时，自由饮水。宰杀时实行宰前电击晕法，然后采用颈部大血管放血法。采集结肠和盲肠内容物消化率样品，用10%稀硫酸进行混合处理后，保存于-20℃待用。采集结肠和盲肠内容物，于灭菌离心管中，保存于-80℃待用。1.4样品筛选进行纤维表观消化率测定。根据NDF表观消化率数据，分别选择7月龄和8月龄NDF消化率最高和最低的5头猪，对结肠和盲肠内容物分解纤维的菌落进行测定。1.5主要试验仪器高压灭菌消毒锅上海申安医疗器械厂；恒温水浴锅北京医疗设备厂；ANKOM A200i半自动纤维分析仪梯度PCR扩增仪美国ABI公司；超净工作台上海博讯实业有限公司；DYY-III2稳压电泳仪北京六一仪器厂；凝胶成像仪美国BIO-RAD伯乐公司；实时荧光定量PCR仪ABI7300，美国ABI公司；低温高速离心机(Centrifuge 581 OR)美国Thermo公司；可调式微量移液器美国Thermo公司；紫外分光光度计美国Thermo公司；千分之一电子天平德国Sartorius公司；定时恒温磁力搅拌器上海沪西分析仪器厂。2 肠道内容物纤维相关消化率测定及纤维分解菌数量测定2.1 NDF、ADF表观消化率的测定中性洗涤纤维(NDF)采用GB/T20806-2006介绍的方法测定。其中消煮器为ANKOMA200i半自动纤维分析仪，100℃下处理75min。NDF（%）＝100×［1-（饲料中AIA的含量×粪便NDF中的含量）/(粪便中AIA的含量×饲料中NDF的含量)］。酸性洗涤纤维（ADF）采用NY/T1459-2007介绍的方法进行测定。2.2 DNA提取使用粪便微生物基因组 DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)进行粪便微生物总DNA的提取。将DNA原液稀释至5ng/μl备用。2.3 引物设计查阅相关文献确定白化瘤胃球菌、柔嫩梭菌的引物序列，本试验引物序列、扩增片段长度及来源文献见表1。表1. PCR引物及相关参数Table 1. PCR primers and related parameters基因名称Gene name序列（5’—3’）Sequence（5’—3’）片段长度Fragment length退火温度annealing temperature参考文献Reference270bp60度[8]白化瘤胃球菌GTTTTAGGATTGTAAACCTCTGTCTTRuminococcus albusCCTAATATCTACGCATTTCACCGC108bp60度[9]柔嫩梭菌CCTTCCGTGCCGSAGTTAClostridium Leptum groupGAATTAAACCACATACTCCACTGCTT2.4目的片段PCR扩增条件的摸索 进行PCR梯度实验。摸索各个细菌的合适退火温度。PCR体系为20μL。反应以55℃为中心温度，摸索范围( 55±5 )℃，反应条件为95℃预变性5min；95℃变性35sec，60℃退火40s，72℃延伸45s，35个循环；72℃保温7min。本试验所有引物最佳退火温度均为60℃。2.5细菌标准品的制备 2.5.1 PCR扩增根据上述特异性引物以及找到的最适退火温度对于不同细菌进行PCR扩增，每个体系设三个重复和一个空白对照, 扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测其片断长度和特异性。反应条件为95℃预变性5min；95℃变性35s，60℃退火40s，72℃延伸45s，35个循环；72℃保温7min。反应结束后，PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分析。2.5.2 利用凝胶电泳技术对扩增结果进行检测PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳检测，若条带明亮说明扩增反应很成功，若条带不明显或者没有，说明扩增反应不成功，需要重新进行扩增反应。 2.5.3 PCR 产物片段纯化 利用PCR产物片段纯化试剂盒对扩增产物进行回收纯化。2.5.4 Vector 载体连接与目的片断的克隆 纯化的 PCR 产物与 PMD19-T Vector 载体连接，在微量离心管中，制备下列连接反应，体系为DNA?4μL，pMD19-T?Vector?1μL，Solution?I 5μL，总体积10μL，16℃金属浴3h。将连接反应体系加入到100μL感受态细胞D5Hα中，热击转化后放置于37℃摇床振荡45min左右；吸取10μL混液加入到含有氨苄抗性的LB固体培养平板，均匀涂板，置于37℃摇床上培养24h，至长出白色菌斑。挑取数个单一白色菌斑于含有氨苄抗性的LB液体培养基，密封，37℃摇床过夜，至液体变浑；同时挑取2种菌的克隆送至南京博津生物技术有限公司进行测序，将测序结果进行同源性分析，与原菌株同源性大于99%，即克隆成功。2.5.5 质粒的提取 使用质粒提取试剂盒提取含有目的片段的质粒。2.5.6 Real-time PCR检测内容物中相关微生物的数量PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段长度，然后经过TianGen普通DNA产物纯化试剂盒纯化，测定PCR产物的浓度，根据公式拷贝数=（DNA质量ng×10-9×6.02×1023）/（660×DNA碱基数）计算出拷贝数，其中CDNA浓度（ng/μL），X 目的片段长度。（1）将标准质粒 DNA 按照 10-1-10-6连续6个浓度梯度稀释，以此为模版，根据各目标菌引物，利用ABI 7300 Real-time PCR仪对结肠内容物中总细菌及相关微生物数量进行扩增和定量分析，梯度稀释标准菌的PCR产物，过程如下表2添加试剂名称及剂量Table 2: name and dosage of reagent added试剂名称Reagent name添加量Amount addedSYBR Green Master（ROX）10μlPCR Foward Primer0.6μlPCR Receive Primer0.6μlDNA1μlddH2O7.8μl反应条件为第一步预变性 95℃ 30sec 第二步PCR反应 95℃ 5sec；60℃ 30sec；35个循环 第三步溶解曲线分析 95℃ 15sec；60℃ 1min；95℃ 15sec。（2）将2种细菌的标准样品和待测样品同时进行PCR反应作为标准曲线。以不同拷贝数的阳性模板的对数为纵坐标，以PCR反应过程中出现荧光信号的初始循环数（Ct）为横坐标绘制而成。待样品和标准曲线进行比较，获得各样品中2种细菌的数量。3 数据统计与分析所有试验数据采用Excel 2010进行初步整理后，再使用SPSS20.0软件详细进行独立样本T检验与相关性分析，结果以平均值±标准误差（Mean±SEM）表示。若P < 0.05则认为其差异显著，若P < 0.01则认为其差异极显著。4 结果与分析4.1粗纤维消化率 表3为苏淮猪7、8月龄NDF、ADF表观消化率比较，由表可知，8月龄苏淮猪的NDF、ADF表观消化率均显著高于7月龄(P<0.05)，说明随着月龄增加，苏淮猪的纤维消化能力显著增强。表4为所筛选出的高低组个体NDF消化率表型。由表可知，相同月龄苏淮猪，所选NDF低消化率组和高消化率组间表观差异极显著（P<0.01）。表3. 苏淮猪7、8月龄NDF、ADF消化率Table3. Digestibility of NDF and ADF of Suhuai pigs in age of 7 and 8 months个体数 Individual numberNDF消化率 NDF digestibilityADF消化率 ADF digestibility7月龄4371.76±1.6162.03±2.398月龄4177.14±1.7870.67±2.74P值0.0280.020表4. 高低组NDF消化率表型Table4. High and low group NDF phenotypic digestibility月龄 Months of age个体数IndividualnumberNDF消化率 NDF digestibilityP值 The value of P低组高组7月龄1052.36±1.5987.13±1.050.0008月龄1056.76±2.3194.82±1.480.0004.2标准曲线柔嫩梭菌 白化瘤胃球菌图1两种细菌绝对定量的标准曲线Fig 1 Standard curve for absolute quantification of the two bacteria图1为两种细菌绝对定量的标准曲线。标准品扩增的值与目标细菌的拷贝数间呈线性相关，R2都大于0.99。将样品Ct值代入上图标准曲线公式，即可计算出所添加样品的lg拷贝数，柔嫩梭菌的标准曲线lg拷贝数=-0.26x+13.226，白化瘤胃球菌的标准曲线lg拷贝数=-0.2583x+12.16。4.3微生物丰度差异分析 白化瘤胃球菌 柔嫩梭菌 图2 七八月龄不同纤维消化组的结肠与盲肠微生物丰度Fig 2 Microbial abundance of colon and cecum in different fiber digestion groups of pigs in the age of 7 and 8 months图2为7月龄和8月苏淮猪最低纤维消化率组与最高纤维消化率组结肠与盲肠内两种纤维分解菌丰度统计。由图2可知4.3.1 结肠与盲肠微生物丰度差异分析对于7月龄苏淮猪而言，在低纤维消化率组与高纤维消化率组中，结肠内白化瘤胃球菌丰度均显著高于盲肠(P=0.027，P=0.012)。而对柔嫩梭菌丰度，只有低消化率组中，结肠内柔嫩梭菌丰度极显著高于盲肠（P=0.006），高消化率组内结肠内柔嫩梭菌丰度具有高于盲肠的趋势（P=0.084）。对于8月龄苏淮猪而言，高纤维消化组结肠内柔嫩梭菌丰度具有高于盲肠的趋势（P=0.081），其余分组两种纤维分解菌的丰度在结肠和盲肠内的差异均不显著。4.3.2 高低纤维消化率组微生物丰度差异分析在7月龄苏淮猪中，对于白化瘤胃球菌和柔嫩梭菌丰度，7月龄低组盲肠内容物的柔嫩梭菌具有高于7月龄高组的趋势（P=0.062），其余分组无论是结肠还是盲肠内容物的纤维分解菌，高消化率组与低消化率组的差异不显著。在8月龄苏淮猪中，对于白化瘤胃球菌和柔嫩梭菌丰度8月龄低组盲肠内容物的白化瘤胃球菌具有高于8月龄高组的趋势（P=0.071）。其余分组结肠与盲肠内纤维分解菌丰度差异不显著。 5 讨论猪大肠分解纤维菌种类的多少和数量的高低本身受到了地理气候、品种、发育阶段、生理状态、日粮成分纤维比例等的影响。所以本次对苏淮猪的试验中已经尽可能的避免这些差异影响。在本试验对苏淮猪相关纤维分解菌研究中,分别对苏淮猪的月龄、消化率高低、大肠位置（结肠与盲肠）三个变量进行了控制与分析。试验通过对七八月龄苏淮猪NDF消化率得出苏淮猪随着日龄的增加，NDF和ADF消化率也会提高。这与他人研究得出的成年猪单位体质量纤维的摄入量小，胃肠道发育完善，消化道长，肠道微生物区系多样性高，纤维降解菌活跃相吻合[10]，因此降解纤维能力比仔猪[11]和生长猪[12]强，有相似之处。但根据粗纤维消化率高低来研究粪便分解菌丰度的尚少。本试验显示苏淮猪肠道内柔嫩梭菌和白化瘤胃球菌丰度结肠显著高于盲肠。而高巍,孟庆翔[13]研究中得出盲肠和直肠内容物中的纤维分解菌的数量显著高于结肠(P<0.01)，这个数据与本次试验结果有些误差。另外，猪品种、日龄以及纤维饲喂量、饲料理化性质、大肠纤维分解菌的相互影响等因素，以及样本数量过少以及试验的操作误差（本人初次试验）也是造成本试验结果与前人研究结果存在差异的原因。6 小结 8月龄苏淮猪的NDF、ADF表观消化率均显著高于7月龄(P<0.05)；7月龄苏淮猪结肠内白化瘤胃球菌丰度显著高于盲肠(P<0.05)，低消化率组中，结肠内柔嫩梭菌丰度极显著高于盲肠（P<0.001）；8月龄苏淮猪结肠和盲肠内白化瘤胃球菌柔嫩梭菌丰度和差异均不显著；7、8月龄苏淮猪结肠、盲肠内容物内白化瘤胃球菌和柔嫩梭菌的丰度在高、低纤维消化率组间均无显著差异。通过初步研究研究苏淮猪肠道纤维分解菌的特征，这对生产过程中合理利用非常规粗饲料, 降低生产成本 ,提高经济效益具有十分重要的指导意义。 致谢参考文献[1] 霍贵成. 地方猪种对纤维饲料利用的研究.[J]. 畜牧兽医学报, 1991, 22 (4): 318-322.[2]张斌,胡建新,龚勇.豫南黑猪耐粗饲性能试验研究 [B].河南畜牧兽医. 2011,32（5）.[3]秦顺涛，罗荣壮，杨炳壮.陆川猪耐粗饲试验[J]. 广西农业科学，1981,1:36-39.[4] 张秀萍. 辽宁荷包猪耐粗饲性能观察试验[J]. 中国畜禽种业 .2014.1(4).[5] Kemp B, den Hartog L A, Klok J J, etal. The digestibility of nutrients, energy and nitrogen in the meishan and dutch landrace pig[J]. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition, 1991, 65 (1-5): 263-266.[6] Degen L,V Halas, and L Babinsky. Effect of dietary fibre on protein and fat digestibility and its consequences on diet formulation for growing and fattening pigs: A review. Acta agriculturae scandinavica. Section A，2007.57: 1-9.[7] Varel V H, Yen J T, Kreikemeier K K. Addition of cellulolytic clostridia to the bovine rumen and pig intestinal tract [J]. Applied and Environmental Microbiology, 1995, 61(3): 1116-1119.[8] Tajima K，Aminov Ｒ, Nagamine T，et al． Diet－dependent shifts in the bacterial population of the rumen revealed with real-time PCＲ［J］．Ap-plied and Environmental Microbiology，2001，67(6):2766－2774．[9] Furet J P，Firmesse O，GourmelonM，et al．Comparative assessment of human and farm animal faecalmicrobiota using real－time quantitative PCＲ［J］．Fems Microbiology Ecology，2009，68(3):351－362．[10] Varel V，Yen J T．Microbial perspective on fiber utilization by swine［J］．Journal of Animal Science，1997，75(10):2715－2722．[11] Weber T E，Ziemer C J，Kerr B J．Effects of adding fibrous feedstuffs to the diet of young pigs on growth performance，intestinal cytokines，and circulating acute-phase proteins［J］． Journal of Animal Science，2008，86(4):871－881．[12] Whitney M H，Shurson G C，Johnston L J，et al．Growth performance and carcass characteristics of grower－finisher pigs fed high-quality corn distillers dried grain with solubles originating from a modern Midwestern ethanol plant［J］． Journal of Animal Science，2006，84(12):3356－3363．[13] 高巍，孟庆翔. 生长育肥猪后肠纤维分解菌的数量及微生物发酵作用[J] .中国农业大学学报 ,2002.4 :33-36.
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法4
1.1试验设计4
1.2日粮及饲养管理4
1.3样品采集4
1.4筛选5
2肠道纤维分解菌数量测定5
2.1纤维消化率测定5
2.2 DNA提取5
2.3引物设计5
2.4目的片段PCR扩增条件的摸索6
2.5细菌标准品的制备6
2.5.1 PCR扩增6
2.5.2 利用凝胶电泳技术对扩增结果进行检测6
2.5.3 PCR产物片段纯化6
2.5.4 Vector载体链接与目的6
2.5.5 质粒的提取7
2.5.6 Realtime PCR检测内容物中相关微生物数量7
3结果与分析7
3.1NDF消化率分析7
3.2标准曲线8
3.3不同纤维消化组的微生物丰度9
4讨论9
5小结10
6致谢10
参考文献10
苏淮猪耐粗饲相关肠道微生物特征初步解析?
引言
rces for pig production, and to some extent alleviate the contradiction between human and pig for grain and reduce feed cost. The fermentation of fiber degradation in intestinal tract of swine mainly from microorganisms, intestinal microbial degradation of fiber has become a research hotspot and an important aspect in the analysis of local pig crude feed tolerance mechanism. Suhuai pig is our self cultivation of new varieties with resistance of crude properties, for its resistance to intestinal microbial mechanism analysis crude, this experiment compared 7 and 8 months of age in Suhuai pigs NDF, apparent digestibility of ADF, July and August were age NDF digestibility of the highest and lowest 5 pigs, the colon and cecum of cellulolytic bacterium by real-time PCR. The difference of digestibility between high and low fiber digestibility, colon and caecum, albino, rumen coccus and Clostridium difficile was studied. The results showed that: NDF, apparent digestibility of ADF of Suhuai pigs in the age of 8 months were significantly higher than that of that of those in the age of 7 months (P<0.05); Albino Ruminococcus abundance in the colon was significantly higher than that in the cecum (P<0.05). For low digestibility group, Clostridium leptum abundance in the colon was significantly higher than that in the caecal (P<0.01). Diferrences of the abundance and the differences of old albino Ruminococcus Clostridium leptum between the colon and cecum of Suhuai pigs in the age of 8 months were not significant. The abundance of albino Ruminococcus and Clostridium leptum in the content of colon and cecum of Suhuai pig in the age of 7 and 8 months were not significant difference between the high and low fiber digestibility group. 伴随着我国人口数目增长、城镇化比重上升、居民生活水平不断提高，以及农产品的工业及能源用途拓展，近年以来我国粮食消费量呈明显的逐年增长趋势。但是我国耕地面积在不断的减少。而且最近几年人民对于猪肉的需求量逐渐加大，因此需要更多的土地资源和饲料来保障猪肉的供应，进而导致“人猪争粮争地”尴尬局面。因此提高饲料利用率和粗纤维消化率显得尤为重要。相对于外国猪种,我国地方猪种对粗纤维含量较高的粗饲料利用率高,耐粗饲能力较强，对粗饲料日粮利用和转化率高，增重明显[1]。张斌、胡建新[2]得出豫南黑猪耐粗饲能力较强，对粗饲料日粮利用和转化率高，增重相对明显优于长白和大约克(P<0.05)。秦顺涛，罗荣壮[3]发现陆川猪也有相对于外国猪种具有很强的耐粗饲能力。张秀萍[4]对荷包猪研究中，发现荷包猪能在极低的营养水平下正常生产，可以大量利用青粗饲料和农副产品下脚料，减少蛋白质饲料的给量，节约饲料资源,进而证明荷包猪具有良好的耐粗饲性能。Kemp等对梅山猪与荷兰长白猪饲喂粗纤维日粮，结果发现梅山猪的日粮粗纤维消化率明显高于长白猪[5]。我国地方品种猪耐粗饲的特性，必然少不了纤维分解菌发挥的作用。猪胃和小肠不能产生降解日粮纤维的酶，消化吸收粗纤维主要通过其大肠中微生物如黄化瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens）、白化瘤胃球菌（Ruminococcus albus）和产琥珀酸丝状杆菌（Fibrobacter succinogenes）、柔嫩梭菌（Clostridium Leptum）等的降解作用来实现[6]。令人意外的是从猪胃肠道分离出来纤维降解活性最强的是草食梭状芽孢杆菌（Clostridium herbivorans）[7]。在猪粪便微生物中也是主导菌群，在猪胃肠道中数量也很高（107个/g食糜），等同于甚至高于瘤胃纤维降解菌。而与之研究我国地方猪种梅山猪体内也被分离出过这种纤维分解菌。苏淮猪是新近培育成功的瘦肉型猪种，利用西方生长速度快、瘦肉率高、对精粮依赖度高的大型约克夏与我国淮安地区生长速度慢、肥胖型、耐粗饲的本地品种淮猪杂交选育的新品种，具有25%的淮猪血统。虽然它保留了淮猪耐粗饲特性，但其耐粗饲的具体机制尚不清楚，推测与其大肠纤维分解菌有关。本试验开展中国地方培育猪种苏淮猪的研究，通过对相同生理阶段的苏淮猪肠道内容物纤维表观消化率的测定，利用荧光定量PCR技术，研究高、低纤维消化率苏淮猪各10头，对其结肠和盲肠内容物内常见纤维分解菌柔嫩梭菌和黄化瘤胃球菌的丰度进行测定，为探究苏淮猪耐粗饲机制提供理论支持，并为培育耐粗饲新猪种提供理论依据。1 材料与方法1.1 试验设计选取出生条件相近的苏淮猪育肥猪。在相同饲养环境下进行饲养，保证健康的前提下,在7月龄和8月龄时进行屠宰，采集肠道内容物消化率样品，用10%稀硫酸进行混合处理，测定肠道内容物的NDF表观消化率，采集结肠和盲肠内容物微生物样品，从中分别选取7月龄及8月龄高、低纤维消化率组各5头提取结肠和盲肠内微生物DNA进行Real-time qPCR试验。饲养试验在淮安市淮阴种猪场进行。饲料中均未添加抗生素等。1.2 日粮及饲养管理，试验在江苏省淮安市淮阴种猪场内，在同栋猪舍、相同饲养条件下进行。试验苏淮猪每日饲喂2次，时间分别为上午8:30-9:30和下午14:30-15:30。试验过程采用干料喂养，饲喂时间段自由采食，全天自由饮水，日常管理与防疫按照淮阴种猪场内生产常规执行。1.3样品采集饲养实验结束后，空腹四小时全部屠宰。禁食12小时，自由饮水。宰杀时实行宰前电击晕法，然后采用颈部大血管放血法。采集结肠和盲肠内容物消化率样品，用10%稀硫酸进行混合处理后，保存于-20℃待用。采集结肠和盲肠内容物，于灭菌离心管中，保存于-80℃待用。1.4样品筛选进行纤维表观消化率测定。根据NDF表观消化率数据，分别选择7月龄和8月龄NDF消化率最高和最低的5头猪，对结肠和盲肠内容物分解纤维的菌落进行测定。1.5主要试验仪器高压灭菌消毒锅上海申安医疗器械厂；恒温水浴锅北京医疗设备厂；ANKOM A200i半自动纤维分析仪梯度PCR扩增仪美国ABI公司；超净工作台上海博讯实业有限公司；DYY-III2稳压电泳仪北京六一仪器厂；凝胶成像仪美国BIO-RAD伯乐公司；实时荧光定量PCR仪ABI7300，美国ABI公司；低温高速离心机(Centrifuge 581 OR)美国Thermo公司；可调式微量移液器美国Thermo公司；紫外分光光度计美国Thermo公司；千分之一电子天平德国Sartorius公司；定时恒温磁力搅拌器上海沪西分析仪器厂。2 肠道内容物纤维相关消化率测定及纤维分解菌数量测定2.1 NDF、ADF表观消化率的测定中性洗涤纤维(NDF)采用GB/T20806-2006介绍的方法测定。其中消煮器为ANKOMA200i半自动纤维分析仪，100℃下处理75min。NDF（%）＝100×［1-（饲料中AIA的含量×粪便NDF中的含量）/(粪便中AIA的含量×饲料中NDF的含量)］。酸性洗涤纤维（ADF）采用NY/T1459-2007介绍的方法进行测定。2.2 DNA提取使用粪便微生物基因组 DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)进行粪便微生物总DNA的提取。将DNA原液稀释至5ng/μl备用。2.3 引物设计查阅相关文献确定白化瘤胃球菌、柔嫩梭菌的引物序列，本试验引物序列、扩增片段长度及来源文献见表1。表1. PCR引物及相关参数Table 1. PCR primers and related parameters基因名称Gene name序列（5’—3’）Sequence（5’—3’）片段长度Fragment length退火温度annealing temperature参考文献Reference270bp60度[8]白化瘤胃球菌GTTTTAGGATTGTAAACCTCTGTCTTRuminococcus albusCCTAATATCTACGCATTTCACCGC108bp60度[9]柔嫩梭菌CCTTCCGTGCCGSAGTTAClostridium Leptum groupGAATTAAACCACATACTCCACTGCTT2.4目的片段PCR扩增条件的摸索 进行PCR梯度实验。摸索各个细菌的合适退火温度。PCR体系为20μL。反应以55℃为中心温度，摸索范围( 55±5 )℃，反应条件为95℃预变性5min；95℃变性35sec，60℃退火40s，72℃延伸45s，35个循环；72℃保温7min。本试验所有引物最佳退火温度均为60℃。2.5细菌标准品的制备 2.5.1 PCR扩增根据上述特异性引物以及找到的最适退火温度对于不同细菌进行PCR扩增，每个体系设三个重复和一个空白对照, 扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测其片断长度和特异性。反应条件为95℃预变性5min；95℃变性35s，60℃退火40s，72℃延伸45s，35个循环；72℃保温7min。反应结束后，PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分析。2.5.2 利用凝胶电泳技术对扩增结果进行检测PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳检测，若条带明亮说明扩增反应很成功，若条带不明显或者没有，说明扩增反应不成功，需要重新进行扩增反应。 2.5.3 PCR 产物片段纯化 利用PCR产物片段纯化试剂盒对扩增产物进行回收纯化。2.5.4 Vector 载体连接与目的片断的克隆 纯化的 PCR 产物与 PMD19-T Vector 载体连接，在微量离心管中，制备下列连接反应，体系为DNA?4μL，pMD19-T?Vector?1μL，Solution?I 5μL，总体积10μL，16℃金属浴3h。将连接反应体系加入到100μL感受态细胞D5Hα中，热击转化后放置于37℃摇床振荡45min左右；吸取10μL混液加入到含有氨苄抗性的LB固体培养平板，均匀涂板，置于37℃摇床上培养24h，至长出白色菌斑。挑取数个单一白色菌斑于含有氨苄抗性的LB液体培养基，密封，37℃摇床过夜，至液体变浑；同时挑取2种菌的克隆送至南京博津生物技术有限公司进行测序，将测序结果进行同源性分析，与原菌株同源性大于99%，即克隆成功。2.5.5 质粒的提取 使用质粒提取试剂盒提取含有目的片段的质粒。2.5.6 Real-time PCR检测内容物中相关微生物的数量PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段长度，然后经过TianGen普通DNA产物纯化试剂盒纯化，测定PCR产物的浓度，根据公式拷贝数=（DNA质量ng×10-9×6.02×1023）/（660×DNA碱基数）计算出拷贝数，其中CDNA浓度（ng/μL），X 目的片段长度。（1）将标准质粒 DNA 按照 10-1-10-6连续6个浓度梯度稀释，以此为模版，根据各目标菌引物，利用ABI 7300 Real-time PCR仪对结肠内容物中总细菌及相关微生物数量进行扩增和定量分析，梯度稀释标准菌的PCR产物，过程如下表2添加试剂名称及剂量Table 2: name and dosage of reagent added试剂名称Reagent name添加量Amount addedSYBR Green Master（ROX）10μlPCR Foward Primer0.6μlPCR Receive Primer0.6μlDNA1μlddH2O7.8μl反应条件为第一步预变性 95℃ 30sec 第二步PCR反应 95℃ 5sec；60℃ 30sec；35个循环 第三步溶解曲线分析 95℃ 15sec；60℃ 1min；95℃ 15sec。（2）将2种细菌的标准样品和待测样品同时进行PCR反应作为标准曲线。以不同拷贝数的阳性模板的对数为纵坐标，以PCR反应过程中出现荧光信号的初始循环数（Ct）为横坐标绘制而成。待样品和标准曲线进行比较，获得各样品中2种细菌的数量。3 数据统计与分析所有试验数据采用Excel 2010进行初步整理后，再使用SPSS20.0软件详细进行独立样本T检验与相关性分析，结果以平均值±标准误差（Mean±SEM）表示。若P < 0.05则认为其差异显著，若P < 0.01则认为其差异极显著。4 结果与分析4.1粗纤维消化率 表3为苏淮猪7、8月龄NDF、ADF表观消化率比较，由表可知，8月龄苏淮猪的NDF、ADF表观消化率均显著高于7月龄(P<0.05)，说明随着月龄增加，苏淮猪的纤维消化能力显著增强。表4为所筛选出的高低组个体NDF消化率表型。由表可知，相同月龄苏淮猪，所选NDF低消化率组和高消化率组间表观差异极显著（P<0.01）。表3. 苏淮猪7、8月龄NDF、ADF消化率Table3. Digestibility of NDF and ADF of Suhuai pigs in age of 7 and 8 months个体数 Individual numberNDF消化率 NDF digestibilityADF消化率 ADF digestibility7月龄4371.76±1.6162.03±2.398月龄4177.14±1.7870.67±2.74P值0.0280.020表4. 高低组NDF消化率表型Table4. High and low group NDF phenotypic digestibility月龄 Months of age个体数IndividualnumberNDF消化率 NDF digestibilityP值 The value of P低组高组7月龄1052.36±1.5987.13±1.050.0008月龄1056.76±2.3194.82±1.480.0004.2标准曲线柔嫩梭菌 白化瘤胃球菌图1两种细菌绝对定量的标准曲线Fig 1 Standard curve for absolute quantification of the two bacteria图1为两种细菌绝对定量的标准曲线。标准品扩增的值与目标细菌的拷贝数间呈线性相关，R2都大于0.99。将样品Ct值代入上图标准曲线公式，即可计算出所添加样品的lg拷贝数，柔嫩梭菌的标准曲线lg拷贝数=-0.26x+13.226，白化瘤胃球菌的标准曲线lg拷贝数=-0.2583x+12.16。4.3微生物丰度差异分析 白化瘤胃球菌 柔嫩梭菌 图2 七八月龄不同纤维消化组的结肠与盲肠微生物丰度Fig 2 Microbial abundance of colon and cecum in different fiber digestion groups of pigs in the age of 7 and 8 months图2为7月龄和8月苏淮猪最低纤维消化率组与最高纤维消化率组结肠与盲肠内两种纤维分解菌丰度统计。由图2可知4.3.1 结肠与盲肠微生物丰度差异分析对于7月龄苏淮猪而言，在低纤维消化率组与高纤维消化率组中，结肠内白化瘤胃球菌丰度均显著高于盲肠(P=0.027，P=0.012)。而对柔嫩梭菌丰度，只有低消化率组中，结肠内柔嫩梭菌丰度极显著高于盲肠（P=0.006），高消化率组内结肠内柔嫩梭菌丰度具有高于盲肠的趋势（P=0.084）。对于8月龄苏淮猪而言，高纤维消化组结肠内柔嫩梭菌丰度具有高于盲肠的趋势（P=0.081），其余分组两种纤维分解菌的丰度在结肠和盲肠内的差异均不显著。4.3.2 高低纤维消化率组微生物丰度差异分析在7月龄苏淮猪中，对于白化瘤胃球菌和柔嫩梭菌丰度，7月龄低组盲肠内容物的柔嫩梭菌具有高于7月龄高组的趋势（P=0.062），其余分组无论是结肠还是盲肠内容物的纤维分解菌，高消化率组与低消化率组的差异不显著。在8月龄苏淮猪中，对于白化瘤胃球菌和柔嫩梭菌丰度8月龄低组盲肠内容物的白化瘤胃球菌具有高于8月龄高组的趋势（P=0.071）。其余分组结肠与盲肠内纤维分解菌丰度差异不显著。 5 讨论猪大肠分解纤维菌种类的多少和数量的高低本身受到了地理气候、品种、发育阶段、生理状态、日粮成分纤维比例等的影响。所以本次对苏淮猪的试验中已经尽可能的避免这些差异影响。在本试验对苏淮猪相关纤维分解菌研究中,分别对苏淮猪的月龄、消化率高低、大肠位置（结肠与盲肠）三个变量进行了控制与分析。试验通过对七八月龄苏淮猪NDF消化率得出苏淮猪随着日龄的增加，NDF和ADF消化率也会提高。这与他人研究得出的成年猪单位体质量纤维的摄入量小，胃肠道发育完善，消化道长，肠道微生物区系多样性高，纤维降解菌活跃相吻合[10]，因此降解纤维能力比仔猪[11]和生长猪[12]强，有相似之处。但根据粗纤维消化率高低来研究粪便分解菌丰度的尚少。本试验显示苏淮猪肠道内柔嫩梭菌和白化瘤胃球菌丰度结肠显著高于盲肠。而高巍,孟庆翔[13]研究中得出盲肠和直肠内容物中的纤维分解菌的数量显著高于结肠(P<0.01)，这个数据与本次试验结果有些误差。另外，猪品种、日龄以及纤维饲喂量、饲料理化性质、大肠纤维分解菌的相互影响等因素，以及样本数量过少以及试验的操作误差（本人初次试验）也是造成本试验结果与前人研究结果存在差异的原因。6 小结 8月龄苏淮猪的NDF、ADF表观消化率均显著高于7月龄(P<0.05)；7月龄苏淮猪结肠内白化瘤胃球菌丰度显著高于盲肠(P<0.05)，低消化率组中，结肠内柔嫩梭菌丰度极显著高于盲肠（P<0.001）；8月龄苏淮猪结肠和盲肠内白化瘤胃球菌柔嫩梭菌丰度和差异均不显著；7、8月龄苏淮猪结肠、盲肠内容物内白化瘤胃球菌和柔嫩梭菌的丰度在高、低纤维消化率组间均无显著差异。通过初步研究研究苏淮猪肠道纤维分解菌的特征，这对生产过程中合理利用非常规粗饲料, 降低生产成本 ,提高经济效益具有十分重要的指导意义。 致谢参考文献[1] 霍贵成. 地方猪种对纤维饲料利用的研究.[J]. 畜牧兽医学报, 1991, 22 (4): 318-322.[2]张斌,胡建新,龚勇.豫南黑猪耐粗饲性能试验研究 [B].河南畜牧兽医. 2011,32（5）.[3]秦顺涛，罗荣壮，杨炳壮.陆川猪耐粗饲试验[J]. 广西农业科学，1981,1:36-39.[4] 张秀萍. 辽宁荷包猪耐粗饲性能观察试验[J]. 中国畜禽种业 .2014.1(4).[5] Kemp B, den Hartog L A, Klok J J, etal. The digestibility of nutrients, energy and nitrogen in the meishan and dutch landrace pig[J]. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition, 1991, 65 (1-5): 263-266.[6] Degen L,V Halas, and L Babinsky. Effect of dietary fibre on protein and fat digestibility and its consequences on diet formulation for growing and fattening pigs: A review. Acta agriculturae scandinavica. Section A，2007.57: 1-9.[7] Varel V H, Yen J T, Kreikemeier K K. Addition of cellulolytic clostridia to the bovine rumen and pig intestinal tract [J]. Applied and Environmental Microbiology, 1995, 61(3): 1116-1119.[8] Tajima K，Aminov Ｒ, Nagamine T，et al． Diet－dependent shifts in the bacterial population of the rumen revealed with real-time PCＲ［J］．Ap-plied and Environmental Microbiology，2001，67(6):2766－2774．[9] Furet J P，Firmesse O，GourmelonM，et al．Comparative assessment of human and farm animal faecalmicrobiota using real－time quantitative PCＲ［J］．Fems Microbiology Ecology，2009，68(3):351－362．[10] Varel V，Yen J T．Microbial perspective on fiber utilization by swine［J］．Journal of Animal Science，1997，75(10):2715－2722．[11] Weber T E，Ziemer C J，Kerr B J．Effects of adding fibrous feedstuffs to the diet of young pigs on growth performance，intestinal cytokines，and circulating acute-phase proteins［J］． Journal of Animal Science，2008，86(4):871－881．[12] Whitney M H，Shurson G C，Johnston L J，et al．Growth performance and carcass characteristics of grower－finisher pigs fed high-quality corn distillers dried grain with solubles originating from a modern Midwestern ethanol plant［J］． Journal of Animal Science，2006，84(12):3356－3363．[13] 高巍，孟庆翔. 生长育肥猪后肠纤维分解菌的数量及微生物发酵作用[J] .中国农业大学学报 ,2002.4 :33-36.
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法4
1.1试验设计4
1.2日粮及饲养管理4
1.3样品采集4
1.4筛选5
2肠道纤维分解菌数量测定5
2.1纤维消化率测定5
2.2 DNA提取5
2.3引物设计5
2.4目的片段PCR扩增条件的摸索6
2.5细菌标准品的制备6
2.5.1 PCR扩增6
2.5.2 利用凝胶电泳技术对扩增结果进行检测6
2.5.3 PCR产物片段纯化6
2.5.4 Vector载体链接与目的6
2.5.5 质粒的提取7
2.5.6 Realtime PCR检测内容物中相关微生物数量7
3结果与分析7
3.1NDF消化率分析7
3.2标准曲线8
3.3不同纤维消化组的微生物丰度9
4讨论9
5小结10
6致谢10
参考文献10
苏淮猪耐粗饲相关肠道微生物特征初步解析?
引言
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