太白洋参多糖的纯化工艺研究及组分分析(附件)
摘 要 以太白洋参药材为研究对象，对太白洋参多糖的纯化工艺进行研究，并对多糖的组分进行了分析。通过水提醇沉法提取太白洋参中的粗多糖PD；Sevage法除蛋白，双氧水脱色，透析除去小分子；使用纤维素阴离子交换剂层析柱（38cm×8cm）进行梯度洗脱，得到PD-1,PD-2,PD-3,PD-4,PD-5五个组分；UV法对多糖的范围进行测定,用HPLC法测太白洋参多糖PD-1的单糖组成。结果表明：①纤维素阴离子交换剂层析柱对太白洋参粗多糖的洗脱是有效的；②太白洋参粗多糖PD-1中单糖组成成分是半乳糖和甘露糖，其比例为34:1。本文对太白洋参多糖的纯化工艺研究及组分分析，为太白洋参药材的应用提供了基本方法。 目 录
1 绪论
1.1 太白洋参简介 1
1.2 多糖的发展前景 1
1.3 测定多糖常用的方法及其优缺点 2
1.3.1 化学法测定多糖的显色方法 2
1.3.2 色谱法在多糖研究中的应用 3
1.3.3 小结 4
2 实验研究
2.1 试药 5
2.2 仪器 5
2.3 纤维素处理及透析袋处理 5
2.3.1 DEAE52纤维素的预处理过程 5
2.3.2 DEAE52纤维素装柱 5
2.3.3 DEAE52纤维素再生 6
2.3.4 透析袋的处理过程 6
2.4 太白洋参粗多糖样品处理 6
2.4.1 太白洋参粗多糖的提取过程 6
2.4.2 太白洋参粗多糖脱蛋白处理 6
2.4.3 太白洋参粗多糖的脱色处理 6
2.5 太白洋参粗多糖的分离纯化 7
2.5.1 蒸馏水洗脱 7
2.5.2 0.05mol/L NaHCO3洗脱 9
2.5.3 0.1mol/L NaHCO3洗脱 10
2.5.4 0.25mol/L NaHCO3洗脱 11
2.5.5 0.5mol/L NaHCO3洗脱 13
2.6 液相色谱法测定PD1的单糖组成 14
2.6.1 液相色谱流动相的选择 14
洗脱 7
2.5.2 0.05mol/L NaHCO3洗脱 9
2.5.3 0.1mol/L NaHCO3洗脱 10
2.5.4 0.25mol/L NaHCO3洗脱 11
2.5.5 0.5mol/L NaHCO3洗脱 13
2.6 液相色谱法测定PD1的单糖组成 14
2.6.1 液相色谱流动相的选择 14
2.6.2 PMP衍生化 14
2.6.3 单糖对照品测定方法及结果 15
2.6.4 PD1样品测定方法及结果 19
3 结论
3.1 结论 20
3.2 实验不足之处及下步工作安排 20
参考文献 21
致谢 23
1 绪论
1.1 太白洋参简介
太白洋参别名黑洋参，是玄参科（scrophularisaceae）植物扭盔马先蒿（Pedicularis davidii Franch）的根茎及根。太白洋参在陕西秦岭地区作为名贵滋补性中药，其性温、味甘、微苦，为补中益气、滋阴补肾、消炎止痛、健脾和胃的良药，它的自然资源丰富，药用价值高，被民间看作为珍贵补品[1] 。现代药理研究结果表明了太白洋参具有健脑益智，提高机体免疫能力，增强机体对有害刺激的抵抗力，抗疲劳和延缓衰老的作用，也可以用于老年性痴呆的预防和治疗[23]。本文对太白洋参多糖的纯化工艺研究及组分分析，为太白洋参药材的应用提供了基本方法。
1.2 多糖的发展前景
多糖是生物体中广泛存在的一类由酮糖或醛糖通过糖苷键连接而成的天然高分子多聚物，是维持生命活动的基本物质之一。研究发现，植物多糖具有很多的生物活性，并且对生物体几乎无副作用，这些引起国内外生物学家、化学家们和药理学家的关注。目前已经有300多种多糖类化合物从天然产物中被分离出来，其中从植物中提取的水溶性多糖最为重要。在植物多糖的生物活性备受关注的同时，其提取工艺也已成为目前研究的焦点之一[4]。我国从多种中草药材中提取活性多糖的纯度已达98%以上。在活性多糖的分离、纯化、分子结构确定及量效关系控制等方面取得重大突破，达到世界领先水平。
植物多糖作为一种重要的天然活性物质，其最大优点是来源广泛，毒副作用小。目前已有猪苓多糖、香菇多糖、灰树花多糖、云芝多糖、牛膝多糖、裂隙葡多糖等应用于临床，他们在抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖、抗溃疡等方面的作用使多糖类药物展现出诱人的前景。我国多糖资源丰富，尤其是来源于中草药的植物多糖具有较大的开发潜力。随着多糖的分离、纯化、结构、合成、药理及临床研究的不断深入，多糖类药物将具有更广阔的应用前景。现在国内外对太白洋参多糖的分离纯化工艺研究及组分测定还远远不够，有待于进一步深化研究[5]。
1.3 测定多糖常用的方法及其优缺点
1.3.1 化学法测定多糖的显色方法
1.3.1.1 苯酚硫酸法
苯酚硫酸法[6]应用的原理是多糖在浓硫酸的作用下水解成单糖并迅速脱水生成糠醛衍生物，与苯酚缩合成有色化合物。主要用于戊糖、寡糖、甲基化的糖以及多聚糖的测定，甚至可以用于糖蛋白和糖肽的测定。该方法具有快速、简单、显色后稳定性较好、重复性好等优点，其优势在于可以进行大量样品的测定，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的有色化合物在120min内颜色稳定。但是苯酚暴露在日光下或者在空气中易被氧化逐渐变成粉红色，因此应进行沙浴回流，用棕色瓶子收集馏出液，得到纯净苯酚。实验室用的苯酚溶液（未加硫酸）应该是现配溶液，配置时需按比例加入一定量的碳酸氢钠和铝片蒸馏，所得到的馏分再加蒸馏水。除此之外每次用的苯酚溶液的浓度应该一致，否则会影响实验结果。苯酚硫酸法只能测定样品中总糖的含量，若样品中含有单糖，则会使样品结果偏高，而且硫酸具有严重的腐蚀性，苯酚易氧化，给实验操作带来极大不便。
1.3.1.2 3,5二硝基水杨酸法
3,5二硝基水杨酸法（简称DNS法）[7]具有快速、操作简便、杂质干扰较小、灵敏度高等优点，是半微量定糖法适用于大量样品的测定。DNS法测定原理是3,5二硝基水杨酸与多糖水解产物还原糖供热后生产棕红色的氨基化合物（3氨基5硝基水杨酸），在一定的范围内，还原糖的含量和反应液颜色成比例关系，利用比色法可测定多糖含量。DNS试剂即3,5二硝基水杨酸试剂可采用直接配置的方法，也可先配置甲液和乙液，再将两液混合。在DNS比色法中色素能与DNS显色剂显色，应用水解前测定值校正水解后的测定值，该方法简便，有效的排除了色素等杂质的干扰。在配置显色剂时加入结晶酚可增加试剂的显色作用，加入亚硫酸钠可进一步增强试剂的稳定性。但是3,5二硝基水杨酸法水解时间要严格控制，否则会影响测定结果的准确性。虽然利用该方法测定可以掩盖苯酚硫酸法测定过程中硫酸带来的腐蚀性，但3,5二硝基水杨酸法所用的试剂比较昂贵，实验室里一般不采纳。
1.3.1.3 蒽酮硫酸法
蒽酮硫酸法[8]的测定原理是多糖类在浓硫酸作用下水解、脱水，再与蒽酮结合成有色化合物，于最大吸收波长处测吸光度[911]。虽然苯酚有毒，是致癌物质，对于某些多糖还可能诱发副反应，导致测量结果不准确，但使用蒽酮可以避免此点不足。蒽酮硫酸法几乎可以测定除戊糖和己糖以外的所有的碳水化合物，而且可以测定多糖类和寡糖类，其中包括纤维素、淀粉等。在测定过程中，待测液
1 绪论
1.1 太白洋参简介 1
1.2 多糖的发展前景 1
1.3 测定多糖常用的方法及其优缺点 2
1.3.1 化学法测定多糖的显色方法 2
1.3.2 色谱法在多糖研究中的应用 3
1.3.3 小结 4
2 实验研究
2.1 试药 5
2.2 仪器 5
2.3 纤维素处理及透析袋处理 5
2.3.1 DEAE52纤维素的预处理过程 5
2.3.2 DEAE52纤维素装柱 5
2.3.3 DEAE52纤维素再生 6
2.3.4 透析袋的处理过程 6
2.4 太白洋参粗多糖样品处理 6
2.4.1 太白洋参粗多糖的提取过程 6
2.4.2 太白洋参粗多糖脱蛋白处理 6
2.4.3 太白洋参粗多糖的脱色处理 6
2.5 太白洋参粗多糖的分离纯化 7
2.5.1 蒸馏水洗脱 7
2.5.2 0.05mol/L NaHCO3洗脱 9
2.5.3 0.1mol/L NaHCO3洗脱 10
2.5.4 0.25mol/L NaHCO3洗脱 11
2.5.5 0.5mol/L NaHCO3洗脱 13
2.6 液相色谱法测定PD1的单糖组成 14
2.6.1 液相色谱流动相的选择 14
洗脱 7
2.5.2 0.05mol/L NaHCO3洗脱 9
2.5.3 0.1mol/L NaHCO3洗脱 10
2.5.4 0.25mol/L NaHCO3洗脱 11
2.5.5 0.5mol/L NaHCO3洗脱 13
2.6 液相色谱法测定PD1的单糖组成 14
2.6.1 液相色谱流动相的选择 14
2.6.2 PMP衍生化 14
2.6.3 单糖对照品测定方法及结果 15
2.6.4 PD1样品测定方法及结果 19
3 结论
3.1 结论 20
3.2 实验不足之处及下步工作安排 20
参考文献 21
致谢 23
1 绪论
1.1 太白洋参简介
太白洋参别名黑洋参，是玄参科（scrophularisaceae）植物扭盔马先蒿（Pedicularis davidii Franch）的根茎及根。太白洋参在陕西秦岭地区作为名贵滋补性中药，其性温、味甘、微苦，为补中益气、滋阴补肾、消炎止痛、健脾和胃的良药，它的自然资源丰富，药用价值高，被民间看作为珍贵补品[1] 。现代药理研究结果表明了太白洋参具有健脑益智，提高机体免疫能力，增强机体对有害刺激的抵抗力，抗疲劳和延缓衰老的作用，也可以用于老年性痴呆的预防和治疗[23]。本文对太白洋参多糖的纯化工艺研究及组分分析，为太白洋参药材的应用提供了基本方法。
1.2 多糖的发展前景
多糖是生物体中广泛存在的一类由酮糖或醛糖通过糖苷键连接而成的天然高分子多聚物，是维持生命活动的基本物质之一。研究发现，植物多糖具有很多的生物活性，并且对生物体几乎无副作用，这些引起国内外生物学家、化学家们和药理学家的关注。目前已经有300多种多糖类化合物从天然产物中被分离出来，其中从植物中提取的水溶性多糖最为重要。在植物多糖的生物活性备受关注的同时，其提取工艺也已成为目前研究的焦点之一[4]。我国从多种中草药材中提取活性多糖的纯度已达98%以上。在活性多糖的分离、纯化、分子结构确定及量效关系控制等方面取得重大突破，达到世界领先水平。
植物多糖作为一种重要的天然活性物质，其最大优点是来源广泛，毒副作用小。目前已有猪苓多糖、香菇多糖、灰树花多糖、云芝多糖、牛膝多糖、裂隙葡多糖等应用于临床，他们在抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖、抗溃疡等方面的作用使多糖类药物展现出诱人的前景。我国多糖资源丰富，尤其是来源于中草药的植物多糖具有较大的开发潜力。随着多糖的分离、纯化、结构、合成、药理及临床研究的不断深入，多糖类药物将具有更广阔的应用前景。现在国内外对太白洋参多糖的分离纯化工艺研究及组分测定还远远不够，有待于进一步深化研究[5]。
1.3 测定多糖常用的方法及其优缺点
1.3.1 化学法测定多糖的显色方法
1.3.1.1 苯酚硫酸法
苯酚硫酸法[6]应用的原理是多糖在浓硫酸的作用下水解成单糖并迅速脱水生成糠醛衍生物，与苯酚缩合成有色化合物。主要用于戊糖、寡糖、甲基化的糖以及多聚糖的测定，甚至可以用于糖蛋白和糖肽的测定。该方法具有快速、简单、显色后稳定性较好、重复性好等优点，其优势在于可以进行大量样品的测定，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的有色化合物在120min内颜色稳定。但是苯酚暴露在日光下或者在空气中易被氧化逐渐变成粉红色，因此应进行沙浴回流，用棕色瓶子收集馏出液，得到纯净苯酚。实验室用的苯酚溶液（未加硫酸）应该是现配溶液，配置时需按比例加入一定量的碳酸氢钠和铝片蒸馏，所得到的馏分再加蒸馏水。除此之外每次用的苯酚溶液的浓度应该一致，否则会影响实验结果。苯酚硫酸法只能测定样品中总糖的含量，若样品中含有单糖，则会使样品结果偏高，而且硫酸具有严重的腐蚀性，苯酚易氧化，给实验操作带来极大不便。
1.3.1.2 3,5二硝基水杨酸法
3,5二硝基水杨酸法（简称DNS法）[7]具有快速、操作简便、杂质干扰较小、灵敏度高等优点，是半微量定糖法适用于大量样品的测定。DNS法测定原理是3,5二硝基水杨酸与多糖水解产物还原糖供热后生产棕红色的氨基化合物（3氨基5硝基水杨酸），在一定的范围内，还原糖的含量和反应液颜色成比例关系，利用比色法可测定多糖含量。DNS试剂即3,5二硝基水杨酸试剂可采用直接配置的方法，也可先配置甲液和乙液，再将两液混合。在DNS比色法中色素能与DNS显色剂显色，应用水解前测定值校正水解后的测定值，该方法简便，有效的排除了色素等杂质的干扰。在配置显色剂时加入结晶酚可增加试剂的显色作用，加入亚硫酸钠可进一步增强试剂的稳定性。但是3,5二硝基水杨酸法水解时间要严格控制，否则会影响测定结果的准确性。虽然利用该方法测定可以掩盖苯酚硫酸法测定过程中硫酸带来的腐蚀性，但3,5二硝基水杨酸法所用的试剂比较昂贵，实验室里一般不采纳。
1.3.1.3 蒽酮硫酸法
蒽酮硫酸法[8]的测定原理是多糖类在浓硫酸作用下水解、脱水，再与蒽酮结合成有色化合物，于最大吸收波长处测吸光度[911]。虽然苯酚有毒，是致癌物质，对于某些多糖还可能诱发副反应，导致测量结果不准确，但使用蒽酮可以避免此点不足。蒽酮硫酸法几乎可以测定除戊糖和己糖以外的所有的碳水化合物，而且可以测定多糖类和寡糖类，其中包括纤维素、淀粉等。在测定过程中，待测液
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