gc和gd基因重组猪伪狂犬病病毒疫苗株鉴定及免疫效力初步研究
本研究室利用细菌人工染色体技术，以Bartha-K61株亲本，将 Bartha-K61的gD替换为变异株AH02LA的gD基因，构建PRV重组BAC， 命名为，pPRV-gDR。以AH02LA为模板，扩增出带有左右同源臂的gC基因，构建了gC-T质粒。本研究采用脂质体转染将pPRV-gDR DNA与质粒 gC-T共转染ST细胞，转染24h后在紫外光激发下观察细胞病变，挑取不发绿色荧光的噬斑，经过2-3轮挑斑筛选和传代获得纯化的gC和gD基因重组猪伪狂犬病病毒株，命名为B-gD&gCR株。PCR鉴定及序列分析显示，gC成功替换。采用0.01感染复数感染ST细胞测定生长特性，48小时病毒滴度达到108.75 TCID50/ml,发现重组病毒生长性能与亲本病毒无显著差异。安全性试验表明伪狂犬病病毒对4周龄仔猪安全。免疫效力初步研究发现，接种B-gD&gCR株的所有仔猪产生对PRV野毒株AH02LA完全的临床保护。以上结果表明B-gD&gCR株成功构建， B-gD&gCR株对仔猪安全并有效抵御PRV AH02LA的攻击。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论） 2
1材料与方法 3
1.1材料 3
1.1.1实验材料 3
1.1.2主要试剂 3
1.1.3主要仪器 3
1.2方法 3
1.2.1引物设计与合成 3
1.2.2pPRVgDR DNA与质粒 gCT DNA的共转染 3
1.2．3重组病毒BgD&gCR的获得和鉴定 4
1.2.4病毒滴度 4
1.2.5病毒生长曲线 4
1.2.6伪狂犬病病毒BgD&gCR株对仔猪的安全性 4
2 结果与分析4
2.1重组病毒筛选和纯化 4
2.2重组病毒鉴定 4
2.3病毒生长曲线 5
2.4对仔猪安全性试验5
2.5免疫效力试验5
3讨论 6
致谢 7
参考文献 8 gC和gD基因重组猪伪狂犬病病毒疫苗株鉴定及免疫 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
效力初步研究
引言
猪伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是一种由伪狂犬病病毒引起的高死亡率的急性传染病。该病在我国发生的情况尤为严重，是危害我国养猪业发展的主要疫病之一。自20世纪70年代起，我国从匈牙利引进了伪狂犬疫苗 Barthak61 株，直到20世纪90年代，国内的规模化猪场普遍都使用该基因缺失疫苗，使猪伪狂犬病的疫情得到了有效控制。然而，自 2011 年以来，一种由伪狂犬病毒变异株引起的猪伪狂犬病在我国暴发，疫情给我国养猪业带来了巨大的经济损失[14]。研究发现，猪伪狂犬病病毒抗原性发生明显的变化，原有的疫苗不能提供完全的保护，因此新型疫苗的研制是控制伪狂犬病的关键。
PR是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus,PRV)感染引起的，其临床症状主要以典型的神经系统疾病、母猪出现死胎、木乃伊胎等繁殖障碍，高烧和呼吸困难以及仔猪的高致死率为特征[5]。PRV属于疱疹病毒科甲型疱疹病毒亚科，其基因组结构为线状双链DNA，长度约为150kb，包括长独特区(UL)、短独特区(US)以及US两侧的重复序列，编码达70多种蛋白[6]。其中有一些病毒复制非必须基因（gE、gI、gG和TK基因），其基因缺失不会影响病毒复制，但导致病毒毒力减弱[7]。gE蛋白还可作为免疫鉴别诊断分子，伪狂犬病毒疫苗株BarthaK61和Bucharest均缺失该基因蛋白，可以通过血清学方法来区分免疫动物与野毒感染动物[8]，从而有利于该病毒的根除。gB、gC和gD是PRV的主要保护性抗体，在病毒感染机体后诱导产生保护性免疫应答中起着重要作用[9]，这些抗原的变异可能是引起Bartha株疫苗保护力不足的重要原因。gD蛋白是PRV的囊膜蛋白，参与病毒对宿主细胞的吸附和穿透过程[10]，gC蛋白是介导病毒吸附至靶细胞的第一个因子，也能诱导细胞免疫。
疫苗免疫是 PRV 防控工作的根本举措，过去的二十多年以来，Bartha 毒株疫苗在全国猪场得到了广泛的推广应用，免疫效果稳定良好，为PR 的预防控制做出了重大的贡献。但2011年末 PRV 变异株出现以后，扰乱了这种稳定的局势，经典疫苗株 BarthaK61 对 PRV 变异株不能再为猪只提供完全的免疫保护[11] ，随着 PRV 抗体阳性检出率的上升以及新生仔猪死亡率和母猪繁殖障碍不断地增加，给养猪业造成了巨大的经济损失。据此，国内许多研究机构针对ZJ01、HN1201、AH02LA、JS2012 等 PRV 变异毒株基因特征、抗原性和致病性等方面做了详细研究的前提下，进一步开展基因缺失和替换弱毒苗的研制[12]。
单基因缺失苗是通过对于变异株 HN1201 进行基因缺失，制出仅单独缺失一个基因的灭活苗。目前认为该疫苗对于仔猪免疫效果稳定，而且做的攻毒保护试验可以证实该疫苗能有效地阻止多种变异株的感染和发病[13]。
双基因缺失苗，有通过对于 JS2012 变异毒株进行 gE 与 gI 双基因缺失所研制出来的疫苗。该疫苗能刺激动物机体产生免疫应答，并抵抗强毒攻击。这种保护效应和机体中和抗体水平并没有必然联系。该疫苗毒不会进行水平和垂直传播，因此安全性良好。但是，双基因缺失苗对日龄较大的猪体来说较为安全，但对刚出生不久的仔猪仍然存在一定程度的毒力隐患[14]。
三基因缺失苗是通过对 HN1201、TJ 和 SNX 等株进行 gE、gI和TK 三种基因的缺失，这种三基因缺失苗不仅有上述双基因缺失苗有的优点，还可以诱导产生高水平的中和抗体，对于仔猪和成年猪来说均比较安全[15,16]。
目前，我国主要采用的是 vZJ01 株 gE/gI 缺失苗，TJ 株的 gE 缺失苗和 HN1201 株 TK/gE/gI 三基因缺失苗来控制和减轻当前流行变异株伪狂犬病的发生[17]。伪狂犬病疫苗免疫虽是能有效控制当前疫情爆发的关键，然而由于病毒传代代次、抗原含量、抗原质量或者佐剂等因素的影响，即使是相同的毒株，不同厂家、来源生产出的疫苗，中和抗体水平相差还相差甚远。面对着不断出现的变异株和新形势下的防疫形势，最有效的疫苗和最优化的免疫程序还有待进一步筛选。
为了解决以上现有技术中猪伪狂犬病疫苗不能抵抗猪伪狂犬变异株感染等问题, 本研究设计了一种可用于制备免疫效率高的疫苗的伪狂犬病毒基因工程gC和gD重组病毒。本研究构建了gC和gD基因重组猪伪狂犬病病毒株（BgD&gCR），比较BgD&gCR和亲本毒株的生长特性，并初步评估了BgD&gCR对仔猪的安全性和免疫效力，为PRV新型疫苗的研究奠定了基础。
1 材料与方法
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论） 2
1材料与方法 3
1.1材料 3
1.1.1实验材料 3
1.1.2主要试剂 3
1.1.3主要仪器 3
1.2方法 3
1.2.1引物设计与合成 3
1.2.2pPRVgDR DNA与质粒 gCT DNA的共转染 3
1.2．3重组病毒BgD&gCR的获得和鉴定 4
1.2.4病毒滴度 4
1.2.5病毒生长曲线 4
1.2.6伪狂犬病病毒BgD&gCR株对仔猪的安全性 4
2 结果与分析4
2.1重组病毒筛选和纯化 4
2.2重组病毒鉴定 4
2.3病毒生长曲线 5
2.4对仔猪安全性试验5
2.5免疫效力试验5
3讨论 6
致谢 7
参考文献 8 gC和gD基因重组猪伪狂犬病病毒疫苗株鉴定及免疫 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
效力初步研究
引言
猪伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是一种由伪狂犬病病毒引起的高死亡率的急性传染病。该病在我国发生的情况尤为严重，是危害我国养猪业发展的主要疫病之一。自20世纪70年代起，我国从匈牙利引进了伪狂犬疫苗 Barthak61 株，直到20世纪90年代，国内的规模化猪场普遍都使用该基因缺失疫苗，使猪伪狂犬病的疫情得到了有效控制。然而，自 2011 年以来，一种由伪狂犬病毒变异株引起的猪伪狂犬病在我国暴发，疫情给我国养猪业带来了巨大的经济损失[14]。研究发现，猪伪狂犬病病毒抗原性发生明显的变化，原有的疫苗不能提供完全的保护，因此新型疫苗的研制是控制伪狂犬病的关键。
PR是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus,PRV)感染引起的，其临床症状主要以典型的神经系统疾病、母猪出现死胎、木乃伊胎等繁殖障碍，高烧和呼吸困难以及仔猪的高致死率为特征[5]。PRV属于疱疹病毒科甲型疱疹病毒亚科，其基因组结构为线状双链DNA，长度约为150kb，包括长独特区(UL)、短独特区(US)以及US两侧的重复序列，编码达70多种蛋白[6]。其中有一些病毒复制非必须基因（gE、gI、gG和TK基因），其基因缺失不会影响病毒复制，但导致病毒毒力减弱[7]。gE蛋白还可作为免疫鉴别诊断分子，伪狂犬病毒疫苗株BarthaK61和Bucharest均缺失该基因蛋白，可以通过血清学方法来区分免疫动物与野毒感染动物[8]，从而有利于该病毒的根除。gB、gC和gD是PRV的主要保护性抗体，在病毒感染机体后诱导产生保护性免疫应答中起着重要作用[9]，这些抗原的变异可能是引起Bartha株疫苗保护力不足的重要原因。gD蛋白是PRV的囊膜蛋白，参与病毒对宿主细胞的吸附和穿透过程[10]，gC蛋白是介导病毒吸附至靶细胞的第一个因子，也能诱导细胞免疫。
疫苗免疫是 PRV 防控工作的根本举措，过去的二十多年以来，Bartha 毒株疫苗在全国猪场得到了广泛的推广应用，免疫效果稳定良好，为PR 的预防控制做出了重大的贡献。但2011年末 PRV 变异株出现以后，扰乱了这种稳定的局势，经典疫苗株 BarthaK61 对 PRV 变异株不能再为猪只提供完全的免疫保护[11] ，随着 PRV 抗体阳性检出率的上升以及新生仔猪死亡率和母猪繁殖障碍不断地增加，给养猪业造成了巨大的经济损失。据此，国内许多研究机构针对ZJ01、HN1201、AH02LA、JS2012 等 PRV 变异毒株基因特征、抗原性和致病性等方面做了详细研究的前提下，进一步开展基因缺失和替换弱毒苗的研制[12]。
单基因缺失苗是通过对于变异株 HN1201 进行基因缺失，制出仅单独缺失一个基因的灭活苗。目前认为该疫苗对于仔猪免疫效果稳定，而且做的攻毒保护试验可以证实该疫苗能有效地阻止多种变异株的感染和发病[13]。
双基因缺失苗，有通过对于 JS2012 变异毒株进行 gE 与 gI 双基因缺失所研制出来的疫苗。该疫苗能刺激动物机体产生免疫应答，并抵抗强毒攻击。这种保护效应和机体中和抗体水平并没有必然联系。该疫苗毒不会进行水平和垂直传播，因此安全性良好。但是，双基因缺失苗对日龄较大的猪体来说较为安全，但对刚出生不久的仔猪仍然存在一定程度的毒力隐患[14]。
三基因缺失苗是通过对 HN1201、TJ 和 SNX 等株进行 gE、gI和TK 三种基因的缺失，这种三基因缺失苗不仅有上述双基因缺失苗有的优点，还可以诱导产生高水平的中和抗体，对于仔猪和成年猪来说均比较安全[15,16]。
目前，我国主要采用的是 vZJ01 株 gE/gI 缺失苗，TJ 株的 gE 缺失苗和 HN1201 株 TK/gE/gI 三基因缺失苗来控制和减轻当前流行变异株伪狂犬病的发生[17]。伪狂犬病疫苗免疫虽是能有效控制当前疫情爆发的关键，然而由于病毒传代代次、抗原含量、抗原质量或者佐剂等因素的影响，即使是相同的毒株，不同厂家、来源生产出的疫苗，中和抗体水平相差还相差甚远。面对着不断出现的变异株和新形势下的防疫形势，最有效的疫苗和最优化的免疫程序还有待进一步筛选。
为了解决以上现有技术中猪伪狂犬病疫苗不能抵抗猪伪狂犬变异株感染等问题, 本研究设计了一种可用于制备免疫效率高的疫苗的伪狂犬病毒基因工程gC和gD重组病毒。本研究构建了gC和gD基因重组猪伪狂犬病病毒株（BgD&gCR），比较BgD&gCR和亲本毒株的生长特性，并初步评估了BgD&gCR对仔猪的安全性和免疫效力，为PRV新型疫苗的研究奠定了基础。
1 材料与方法
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