siva1在猪卵巢颗粒细胞凋亡中的作用
Siva-1是Siva促凋亡蛋白家族中的重要组成之一，在多种细胞信号通路和细胞凋亡过程中起到重要作用。目前关于Siva-1基因在哺乳动物卵巢颗粒细胞中作用的研究还未见报道。本文根据猪Siva-1编码区序列设计了特异的siRNA，转染体外培养的猪卵巢颗粒细胞，采用qRT-PCR和western blot技术检测敲减效果，流式细胞技术检测Siva-1敲减后猪卵巢颗粒细胞凋亡率，qRT-PCR检测Siva-1靶基因Bcl-2表达水平。结果显示转染Siva-1-siRNA后猪卵巢颗粒细胞中Siva-1基因mRNA水平显著下调（P<0.05），Siva-1蛋白水平极显著下调（P<0.01），说明设计的Siva-1-siRNA可有效敲减猪卵巢颗粒细胞中内源性Siva-1的表达；流式细胞技术发现Siva-1敲减后猪卵巢颗粒细胞凋亡率和早期凋亡率极显著下降（P<0.01），但晚期凋亡率差异不显著（P>0.05）；敲减Siva-1后猪卵巢颗粒细胞中Siva-1靶基因Bcl-2表达水平极显著上调（P<0.01）。结果表明Siva-1是猪卵巢颗粒细胞的促凋亡因子，可能通过抑制抗凋亡关键因子Bcl-2来发挥作用。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1□材料与方法4
1.1□引物设计与合成4
1.2□干扰RNA的合成4
1.3□转染5
1.4□RNA提取5
1.5□RNA反转录5
1.6□荧光剂实时定量PCR检测5
1.7□Western blot5
1.8□AnnexinVPI染色6
1.9□数据统计与分析6
2□结果与分析6
2.1□PCR产物检测6
2.2□Siva1siRNA对猪卵巢颗粒细胞中Siva1基因mRNA表达的影响7
2.3□Siva1敲减对猪卵巢颗粒细胞中Siva1蛋白表达的影响7
2.4□Siva1敲减对猪卵巢颗粒细胞中细胞凋亡率的影响8
2.5□Siva1敲减对猪卵巢颗粒细胞中Bcl2基因表达的影响9
3□讨论9 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
致谢10
参考文献10
Siva1在猪卵巢颗粒细胞凋亡中的作用
引言
猪卵巢卵泡主要由卵母细胞、体细胞（如颗粒细胞和卵泡膜细胞等）和卵泡液等组成，其中颗粒细胞能够合成和分泌多种活性肽如抑制素、卵泡抑素和激活素等，这些活性蛋白不仅参与调节垂体释放卵泡刺激素（FSH），而且可以作为卵泡发育的局部调节因子，对卵泡的成熟发育起着至关重要的作用。在大多数哺乳动物体内，有7099.9%的卵泡在排卵前就发生卵泡闭锁，只有少数卵泡细胞最终能够进行排卵。研究表明，在卵泡发生闭锁的过程中，颗粒细胞也产生相应变化，例如颗粒细胞核发生固缩，细胞质内出现空腔，颗粒细胞与周围细胞分离脱落，分解形成闭锁小体，即颗粒细胞凋亡。随着深入研究发现，颗粒细胞凋亡现象的发生早于卵泡闭锁，并进一步证实卵泡闭锁是由于颗粒细胞凋亡引起的。在猪卵巢卵泡闭锁过程中，促凋亡基因Caspase3、BAX和BIM的表达水平显着上调，而抗凋亡基因BCL2和MCL1显著下调[1]。卵巢颗粒细胞凋亡能够引发卵泡闭锁，同时卵泡的选择也依赖于颗粒细胞的凋亡。因此，探索颗粒细胞凋亡的作用机制对于调控猪卵泡发育和提高猪繁殖力等有着重大的意义。
细胞凋亡是在多基因联合控制下的细胞程序性死亡过程，受促凋亡基因和抗凋亡基因的共同调节。Siva是近年来发现的促凋亡蛋白家族，其最初是通过酵母双杂交技术克隆得到的一段的cDNA序列， Siva1是凋亡调节因子Siva编码的选择性剪接体之一。作为促凋亡蛋白家族Siva中的一员，Siva1可以与多种受体进行结合，进行信号传导，其在攻克目前难以得到有效解决方法的疑难杂症上具有较大的潜力，引起人们的广泛关注，越来越多的学者投入到对Siva1的研究之中。研究发现Siva1不仅能够作用于CD27所介导的细胞凋亡，还可作用于多条细胞凋亡通路，如可以参与p53引起的细胞凋亡[2]，抑制Bcl2/BclxL的抑凋亡功能[3]。在参与其他多种细胞凋亡通路同时，Siva1还可以抑制NFkappaB的活性[4]，并且可以通过与非受体酪氨酸激酶cAbl相互作用来诱导细胞凋亡[5]。在参与抑制Bcl2/BclxL作用的通路中，Siva1因为其NH2末端具有一个独特的由20个氨基酸构成的两亲性螺旋区（SAH），通过SAH区域，Siva1可以结合Bcl2并消除它们的抗凋亡活性，从而使细胞对UV辐射诱导的细胞敏感而致其凋亡[3] 。SAH介导的细胞凋亡的作用的基础机制是使细胞中线粒体的完整性丧失，引起促凋亡蛋白Bax的活化，该蛋白可以诱导线粒体释放细胞色素c、形成凋亡小体或启动Caspase9和Caspase3最终的活化，最后凋亡执行因子Caspase被活化，通过蛋白水解酶使细胞崩溃，走向凋亡[6] 。
Siva1是细胞凋亡的主要调节因子，但目前关于其在卵巢颗粒细胞凋亡中的作用还未见报道。本研究拟通过敲减猪卵巢颗粒细胞中的Siva1基因，研究Siva1在猪卵巢颗粒细胞凋亡中的作用，及其作用机制，以期为解析猪卵泡闭锁机制提供参考。
1 材料与方法
1．1 引物设计与合成
根据GenBank中收录的相应基因（Siva1、Bcl2和GAPDH）的mRNA序列，应用Primer 5.0软件设计引物，用于基因定量分析。引物序列信息和扩增条件见表1。
1．2 干扰RNA的合成
用于敲减猪Siva1的siRNA由上海吉玛生物公司合成。Siva1siRNA序列为：5′GAU CAU GCA GCU CCU CUU UTT 3′，5′AAA GAG GAG CUG CAU GAU CTT3′。NCsiRNA编号为4611。利用脂质体2000将Siva1siRNA和NCsiRNA分别转染体外培养的猪卵泡颗粒细胞中，具体方法见操作说明书。
1．3 转染
1．3．1 转染24h前，胰酶消化细胞，进行细胞铺板操作。细胞铺板在含有2ml血清、培养基中（培养基中不含抗生素），使其在进行转染前能够达到90%95%的融合度。
1．3．2 对于培养基中每孔所含有的细胞，均使用2ml无血清培养基对4.0μg质粒进行稀释，充分混匀。使用前取Lipofecatamine2000转染试剂，轻轻混匀。每孔细胞用250μl无血清培养基稀释10μl Lipofectamine2000转染试剂。轻轻混匀后在室温条件下孵育5min。将孵育好的Lipofectamine2000转染试剂同稀释好的质粒混合，因为长时间孵育会影响转染活性，所以混合时间要控制在30min以内。稀释的Lipofectamine2000和混合稀释的质粒体积总的为500μL。轻轻混匀，在室温条件下放置20min，使得DNA Lipofectamine2000复合物形成。
表1 引物序列信息和扩增条件
Table1 Primer sequence information and amplification conditions
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1□材料与方法4
1.1□引物设计与合成4
1.2□干扰RNA的合成4
1.3□转染5
1.4□RNA提取5
1.5□RNA反转录5
1.6□荧光剂实时定量PCR检测5
1.7□Western blot5
1.8□AnnexinVPI染色6
1.9□数据统计与分析6
2□结果与分析6
2.1□PCR产物检测6
2.2□Siva1siRNA对猪卵巢颗粒细胞中Siva1基因mRNA表达的影响7
2.3□Siva1敲减对猪卵巢颗粒细胞中Siva1蛋白表达的影响7
2.4□Siva1敲减对猪卵巢颗粒细胞中细胞凋亡率的影响8
2.5□Siva1敲减对猪卵巢颗粒细胞中Bcl2基因表达的影响9
3□讨论9 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
致谢10
参考文献10
Siva1在猪卵巢颗粒细胞凋亡中的作用
引言
猪卵巢卵泡主要由卵母细胞、体细胞（如颗粒细胞和卵泡膜细胞等）和卵泡液等组成，其中颗粒细胞能够合成和分泌多种活性肽如抑制素、卵泡抑素和激活素等，这些活性蛋白不仅参与调节垂体释放卵泡刺激素（FSH），而且可以作为卵泡发育的局部调节因子，对卵泡的成熟发育起着至关重要的作用。在大多数哺乳动物体内，有7099.9%的卵泡在排卵前就发生卵泡闭锁，只有少数卵泡细胞最终能够进行排卵。研究表明，在卵泡发生闭锁的过程中，颗粒细胞也产生相应变化，例如颗粒细胞核发生固缩，细胞质内出现空腔，颗粒细胞与周围细胞分离脱落，分解形成闭锁小体，即颗粒细胞凋亡。随着深入研究发现，颗粒细胞凋亡现象的发生早于卵泡闭锁，并进一步证实卵泡闭锁是由于颗粒细胞凋亡引起的。在猪卵巢卵泡闭锁过程中，促凋亡基因Caspase3、BAX和BIM的表达水平显着上调，而抗凋亡基因BCL2和MCL1显著下调[1]。卵巢颗粒细胞凋亡能够引发卵泡闭锁，同时卵泡的选择也依赖于颗粒细胞的凋亡。因此，探索颗粒细胞凋亡的作用机制对于调控猪卵泡发育和提高猪繁殖力等有着重大的意义。
细胞凋亡是在多基因联合控制下的细胞程序性死亡过程，受促凋亡基因和抗凋亡基因的共同调节。Siva是近年来发现的促凋亡蛋白家族，其最初是通过酵母双杂交技术克隆得到的一段的cDNA序列， Siva1是凋亡调节因子Siva编码的选择性剪接体之一。作为促凋亡蛋白家族Siva中的一员，Siva1可以与多种受体进行结合，进行信号传导，其在攻克目前难以得到有效解决方法的疑难杂症上具有较大的潜力，引起人们的广泛关注，越来越多的学者投入到对Siva1的研究之中。研究发现Siva1不仅能够作用于CD27所介导的细胞凋亡，还可作用于多条细胞凋亡通路，如可以参与p53引起的细胞凋亡[2]，抑制Bcl2/BclxL的抑凋亡功能[3]。在参与其他多种细胞凋亡通路同时，Siva1还可以抑制NFkappaB的活性[4]，并且可以通过与非受体酪氨酸激酶cAbl相互作用来诱导细胞凋亡[5]。在参与抑制Bcl2/BclxL作用的通路中，Siva1因为其NH2末端具有一个独特的由20个氨基酸构成的两亲性螺旋区（SAH），通过SAH区域，Siva1可以结合Bcl2并消除它们的抗凋亡活性，从而使细胞对UV辐射诱导的细胞敏感而致其凋亡[3] 。SAH介导的细胞凋亡的作用的基础机制是使细胞中线粒体的完整性丧失，引起促凋亡蛋白Bax的活化，该蛋白可以诱导线粒体释放细胞色素c、形成凋亡小体或启动Caspase9和Caspase3最终的活化，最后凋亡执行因子Caspase被活化，通过蛋白水解酶使细胞崩溃，走向凋亡[6] 。
Siva1是细胞凋亡的主要调节因子，但目前关于其在卵巢颗粒细胞凋亡中的作用还未见报道。本研究拟通过敲减猪卵巢颗粒细胞中的Siva1基因，研究Siva1在猪卵巢颗粒细胞凋亡中的作用，及其作用机制，以期为解析猪卵泡闭锁机制提供参考。
1 材料与方法
1．1 引物设计与合成
根据GenBank中收录的相应基因（Siva1、Bcl2和GAPDH）的mRNA序列，应用Primer 5.0软件设计引物，用于基因定量分析。引物序列信息和扩增条件见表1。
1．2 干扰RNA的合成
用于敲减猪Siva1的siRNA由上海吉玛生物公司合成。Siva1siRNA序列为：5′GAU CAU GCA GCU CCU CUU UTT 3′，5′AAA GAG GAG CUG CAU GAU CTT3′。NCsiRNA编号为4611。利用脂质体2000将Siva1siRNA和NCsiRNA分别转染体外培养的猪卵泡颗粒细胞中，具体方法见操作说明书。
1．3 转染
1．3．1 转染24h前，胰酶消化细胞，进行细胞铺板操作。细胞铺板在含有2ml血清、培养基中（培养基中不含抗生素），使其在进行转染前能够达到90%95%的融合度。
1．3．2 对于培养基中每孔所含有的细胞，均使用2ml无血清培养基对4.0μg质粒进行稀释，充分混匀。使用前取Lipofecatamine2000转染试剂，轻轻混匀。每孔细胞用250μl无血清培养基稀释10μl Lipofectamine2000转染试剂。轻轻混匀后在室温条件下孵育5min。将孵育好的Lipofectamine2000转染试剂同稀释好的质粒混合，因为长时间孵育会影响转染活性，所以混合时间要控制在30min以内。稀释的Lipofectamine2000和混合稀释的质粒体积总的为500μL。轻轻混匀，在室温条件下放置20min，使得DNA Lipofectamine2000复合物形成。
表1 引物序列信息和扩增条件
Table1 Primer sequence information and amplification conditions
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