以非常规饲料为原料的母羊TMR饲喂技术
以非常规饲料为原料的母羊TMR饲喂技术[20200510205640]
摘要：为调查我国当前仔猪断奶前后粪便中肠球菌耐药性的流行情况，断奶前后肠球菌耐药率的动态变化，本试验在仔猪7日龄及断奶稳定采食一个月后，分别采集了相同四窝（每窝2头）仔猪粪便，分离肠球菌。根据美国临床和实验室标准协会（CLSI）推荐的平板稀释法测定了红霉素、恩诺沙星、青霉素、氨苄西林、氯霉素、万古霉素、氟苯尼考、四环素、高浓度庆大霉素和高浓度链霉素等10种抗生素对分离菌株的最小抑菌浓度。结果表明：断奶后菌株对红霉素（P < 0.05）、恩诺沙星（P < 0.01）、青霉素（P < 0.01）的耐受率显著升高；对高浓度庆大霉素（P < 0.05）、高浓度链霉素（P < 0.01）和氯霉素（P < 0.01）耐受率显著降低；对氟苯尼考、四环素、万古霉素和氨苄西林无显著性差异且对万古霉素全部敏感，但断奶后对万古霉素的MIC值显著升高（P < 0.05），对氨苄西林的MIC值有升高的趋势（P = 0.077）。结果提示，抗生素耐受性在仔猪断奶前后存在一定的普遍性，相当一部分菌株呈现多药耐药。
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关键字:肠球菌；仔猪；最小抑菌浓度；耐药率
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
引言 3
1 材料与方法 4
1.1 材料 4
1.1.1 样品采集 4
1.1.2 抗菌药物及试剂 4
1.1.3 质控标准菌株 4
1.1.4 仪器设备与器材处理 4
1.2 方法 4
1.2.1 肠球菌的分离 4
1.2.2 菌株鉴定 5
1.2.3 细菌敏感性试验 5
1.2.4 饲料样品抗菌药物添加量测定 6
2 数据分析 6
3 结果 6
3.1 肠球菌的分离 6
3.2 分离肠球菌对抗菌药物的敏感性 6
3.3 饲料中抗菌药物测定 7
4 讨论 7
5 结论 8
致谢 8
参考文献 9
仔猪断奶前后粪便中肠球菌耐药性比较
引言
引言
肠球菌作为人和动物肠道中的正常菌群，其广泛存在于自然环境中，主要是人类和动物的黏膜表面，此外也可从土壤、水源、奶产品及其他食物源和植物中分离[1]。肠球菌是革兰氏阳性兼性厌氧的卵圆形球菌，常呈可变长度的链状。其生存及适应能力强，能够在一些严苛条件下生存（包括高盐），并具有较为宽泛的生长温度范围（从10 ℃至>45 ℃）[2]。首例肠球菌感染，即感染性心内膜炎是在1899年被报道[3]，随后发现，肠球菌能够引起一系列的感染性疾病（包括骨盆感染，新生儿感染以及泌尿道感染（urinary tract infections，UTIs）。肠球菌在近一百多年的时间里，作为 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
引起心内膜炎的致病菌而被人们所知，如若不能做出有效的治疗，则常导致死亡。然而，尽管肠球菌具有潜在的致病性，通常表现出较低水平的毒力，且在大多数人和动物消化道内作为正常的定植菌，因此在人和农场动物上也被用作安全性的益生菌[2]。
现代养猪生产中，为提高经济效益，仔猪一般于21至28日龄断奶，此时的仔猪自身消化、免疫等功能发育尚不成熟，却要面对由液态母乳转变为固态饲料、和离开母猪并混群的双重挑战，因此断奶仔猪腹泻是常见的现象。为预防断奶仔猪腹泻和促生长，饲料中添加抗生素和高铜是当前普遍采用的营养策略。但近些年来，我国养殖场普遍存在着抗菌药物滥用的情况，且养殖环境污染较为严重，尤其是万古霉素耐药肠球菌（vancomycin resistant Enterococcus，VRE）的出现打破了“人类对付顽固性耐药菌住的最后一道防线”[4]。因此肠球菌作为猪肠道中的一种条件致病菌，其耐药性得到了广泛关注。为此，作者调查了江苏某猪场仔猪断奶前后粪便中肠球菌的耐药表型情况，为耐药肠球菌的流行病学提供基础数据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品采集
2013年7月-2013年9月从江苏省宜兴地区某猪场随机采集4窝健康（每窝2只）7日龄仔猪粪便样品，在仔猪断奶稳定采食一个月后，采集原相应8只仔猪粪便样品。在此期间，仔猪未发生疫病，采集仔猪饲料样品（教槽料和仔猪断奶前期料）。
1.1.2 抗菌药物及试剂
本试验使用选取种抗菌药物对照品：万古霉素（VAN），红霉素（ERY），氯霉素（CHL），四环素（TET），恩诺沙星（ENR），庆大霉素(GEN)，链霉素(STR)购自生工生物工程股份有限公司；氟苯尼考（FFC），氨苄西林（AMP）购自南京龙斌生物科技有限公司；青霉素（PEN）购自大连美仑生物技术有限公司。胆汁七叶苷叠氮钠琼脂，脑心浸液琼脂，脑心浸液肉汤，Muller Hinton琼脂，Muller Hinton肉汤，6.5%NaCl，过氧化氢酶微量生化鉴定试剂购自青岛海博生物技术有限公司。
1.1.3 质控标准菌株
粪肠球菌ATCC29212，购自广东微生物菌种保存中心。
1.1.4 仪器设备与器材处理
超净工作台、移液器、试管架、酒精灯、涂布器、涡旋仪、恒温培养箱，96孔板、多点接种器、容量瓶、烧杯、玻璃棒、有机相滤膜、离心管、冻存管等。接触样品的所有器皿需经高压灭菌后使用；配制抗菌药物原液用容量瓶、烧杯等需玻璃器材需在酸缸内浸泡24 h后，先用清水充分洗涤3-5遍，再用去离子水洗涤2-3遍，晾干，以便充分去除药物原液配制的杂质干扰因素。
1.2 方法
1.2.1 肠球菌的分离
取1 g粪便样品，加入到灭菌15 mL离心管中，用蛋白胨水进行1:10梯度稀释（10-1稀释度）。样品置于涡旋仪上充分震荡混匀，用蛋白胨水稀释到10-2至10-4。从每个梯度的稀释液中吸取100 μL加入到胆汁七叶苷叠氮钠琼脂上涂布，每个梯度2个重复，37 ℃培养24 h；挑取平板上带棕色环的棕黑色单个菌落，在脑心浸液琼脂上划线，于37 ℃培养24 h；挑取单菌落，接种于5 mL脑心浸液肉汤中，增菌12-18 h，加入终浓度20 %甘油，-20 ℃保存。
1.2.2 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
菌株鉴定
通过45 ℃生长试验（阳性），6.5 %氯化钠（阳性），触酶试验（阴性）微量生化鉴定及革兰氏染色（阳性），对分离菌株进行肠球菌属细菌的确证。
1.2.3 细菌敏感性试验
严格按照美国临床和实验室标准协会（CLSI）推荐的方法操作，对鉴定出的肠球菌采用平板稀释法测定其对万古霉素（VAN），红霉素（ERY），氯霉素（CHL），四环素（TET），恩诺沙星（ENR），氟苯尼考（FFC），氨苄西林（AMP），青霉素（PEN）等抗菌药物的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）检测其对高浓度庆大霉素（high-level gentamicin resistance，HLGR），高浓度链霉素（high-level streptomycin resistance，HLSR）的耐受情况。为保证试验的准确性，所有菌株的最小抑菌浓度测定重复两次。质控菌株（quality control，QC）ATCC29212的MIC范围及抗菌药物的耐药折点如表1所示。多药耐药菌株（mutidrug resistant，MDR）定义为至少对三类抗菌药物耐受的菌株[5]。
表1 质控菌MIC范围，抗菌药物测定范围及平板稀释法下抗菌药物敏感性测试耐药折点
抗菌药物 质控菌MIC范围b 测定范围 MICa折点（μg mL-1）c
敏感 中介 耐药
青霉素 1-4 0.25-128 ≤8 - ≥16
氨苄西林 0.5-2 0.0625-128 ≤8 - ≥16
仔猪1-2 15 12
仔猪2-1 18 14
仔猪2-2 14 14
仔猪3-1 2 12
仔猪3-2 15 14
仔猪4-1 15 13
仔猪4-2 0 14
[4] Kos, V.N., et al., Comparative genomics of vancomycin-resistant Staphylococcus aureus strains and their positions within the clade most commonly associated with methicillin-resistant S. aureus hospital-acquired infection in the United States. MBio, 2012. 3(3): p. e00112-12.
摘要：为调查我国当前仔猪断奶前后粪便中肠球菌耐药性的流行情况，断奶前后肠球菌耐药率的动态变化，本试验在仔猪7日龄及断奶稳定采食一个月后，分别采集了相同四窝（每窝2头）仔猪粪便，分离肠球菌。根据美国临床和实验室标准协会（CLSI）推荐的平板稀释法测定了红霉素、恩诺沙星、青霉素、氨苄西林、氯霉素、万古霉素、氟苯尼考、四环素、高浓度庆大霉素和高浓度链霉素等10种抗生素对分离菌株的最小抑菌浓度。结果表明：断奶后菌株对红霉素（P < 0.05）、恩诺沙星（P < 0.01）、青霉素（P < 0.01）的耐受率显著升高；对高浓度庆大霉素（P < 0.05）、高浓度链霉素（P < 0.01）和氯霉素（P < 0.01）耐受率显著降低；对氟苯尼考、四环素、万古霉素和氨苄西林无显著性差异且对万古霉素全部敏感，但断奶后对万古霉素的MIC值显著升高（P < 0.05），对氨苄西林的MIC值有升高的趋势（P = 0.077）。结果提示，抗生素耐受性在仔猪断奶前后存在一定的普遍性，相当一部分菌株呈现多药耐药。
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关键字:肠球菌；仔猪；最小抑菌浓度；耐药率
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
引言 3
1 材料与方法 4
1.1 材料 4
1.1.1 样品采集 4
1.1.2 抗菌药物及试剂 4
1.1.3 质控标准菌株 4
1.1.4 仪器设备与器材处理 4
1.2 方法 4
1.2.1 肠球菌的分离 4
1.2.2 菌株鉴定 5
1.2.3 细菌敏感性试验 5
1.2.4 饲料样品抗菌药物添加量测定 6
2 数据分析 6
3 结果 6
3.1 肠球菌的分离 6
3.2 分离肠球菌对抗菌药物的敏感性 6
3.3 饲料中抗菌药物测定 7
4 讨论 7
5 结论 8
致谢 8
参考文献 9
仔猪断奶前后粪便中肠球菌耐药性比较
引言
引言
肠球菌作为人和动物肠道中的正常菌群，其广泛存在于自然环境中，主要是人类和动物的黏膜表面，此外也可从土壤、水源、奶产品及其他食物源和植物中分离[1]。肠球菌是革兰氏阳性兼性厌氧的卵圆形球菌，常呈可变长度的链状。其生存及适应能力强，能够在一些严苛条件下生存（包括高盐），并具有较为宽泛的生长温度范围（从10 ℃至>45 ℃）[2]。首例肠球菌感染，即感染性心内膜炎是在1899年被报道[3]，随后发现，肠球菌能够引起一系列的感染性疾病（包括骨盆感染，新生儿感染以及泌尿道感染（urinary tract infections，UTIs）。肠球菌在近一百多年的时间里，作为 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
引起心内膜炎的致病菌而被人们所知，如若不能做出有效的治疗，则常导致死亡。然而，尽管肠球菌具有潜在的致病性，通常表现出较低水平的毒力，且在大多数人和动物消化道内作为正常的定植菌，因此在人和农场动物上也被用作安全性的益生菌[2]。
现代养猪生产中，为提高经济效益，仔猪一般于21至28日龄断奶，此时的仔猪自身消化、免疫等功能发育尚不成熟，却要面对由液态母乳转变为固态饲料、和离开母猪并混群的双重挑战，因此断奶仔猪腹泻是常见的现象。为预防断奶仔猪腹泻和促生长，饲料中添加抗生素和高铜是当前普遍采用的营养策略。但近些年来，我国养殖场普遍存在着抗菌药物滥用的情况，且养殖环境污染较为严重，尤其是万古霉素耐药肠球菌（vancomycin resistant Enterococcus，VRE）的出现打破了“人类对付顽固性耐药菌住的最后一道防线”[4]。因此肠球菌作为猪肠道中的一种条件致病菌，其耐药性得到了广泛关注。为此，作者调查了江苏某猪场仔猪断奶前后粪便中肠球菌的耐药表型情况，为耐药肠球菌的流行病学提供基础数据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品采集
2013年7月-2013年9月从江苏省宜兴地区某猪场随机采集4窝健康（每窝2只）7日龄仔猪粪便样品，在仔猪断奶稳定采食一个月后，采集原相应8只仔猪粪便样品。在此期间，仔猪未发生疫病，采集仔猪饲料样品（教槽料和仔猪断奶前期料）。
1.1.2 抗菌药物及试剂
本试验使用选取种抗菌药物对照品：万古霉素（VAN），红霉素（ERY），氯霉素（CHL），四环素（TET），恩诺沙星（ENR），庆大霉素(GEN)，链霉素(STR)购自生工生物工程股份有限公司；氟苯尼考（FFC），氨苄西林（AMP）购自南京龙斌生物科技有限公司；青霉素（PEN）购自大连美仑生物技术有限公司。胆汁七叶苷叠氮钠琼脂，脑心浸液琼脂，脑心浸液肉汤，Muller Hinton琼脂，Muller Hinton肉汤，6.5%NaCl，过氧化氢酶微量生化鉴定试剂购自青岛海博生物技术有限公司。
1.1.3 质控标准菌株
粪肠球菌ATCC29212，购自广东微生物菌种保存中心。
1.1.4 仪器设备与器材处理
超净工作台、移液器、试管架、酒精灯、涂布器、涡旋仪、恒温培养箱，96孔板、多点接种器、容量瓶、烧杯、玻璃棒、有机相滤膜、离心管、冻存管等。接触样品的所有器皿需经高压灭菌后使用；配制抗菌药物原液用容量瓶、烧杯等需玻璃器材需在酸缸内浸泡24 h后，先用清水充分洗涤3-5遍，再用去离子水洗涤2-3遍，晾干，以便充分去除药物原液配制的杂质干扰因素。
1.2 方法
1.2.1 肠球菌的分离
取1 g粪便样品，加入到灭菌15 mL离心管中，用蛋白胨水进行1:10梯度稀释（10-1稀释度）。样品置于涡旋仪上充分震荡混匀，用蛋白胨水稀释到10-2至10-4。从每个梯度的稀释液中吸取100 μL加入到胆汁七叶苷叠氮钠琼脂上涂布，每个梯度2个重复，37 ℃培养24 h；挑取平板上带棕色环的棕黑色单个菌落，在脑心浸液琼脂上划线，于37 ℃培养24 h；挑取单菌落，接种于5 mL脑心浸液肉汤中，增菌12-18 h，加入终浓度20 %甘油，-20 ℃保存。
1.2.2 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
菌株鉴定
通过45 ℃生长试验（阳性），6.5 %氯化钠（阳性），触酶试验（阴性）微量生化鉴定及革兰氏染色（阳性），对分离菌株进行肠球菌属细菌的确证。
1.2.3 细菌敏感性试验
严格按照美国临床和实验室标准协会（CLSI）推荐的方法操作，对鉴定出的肠球菌采用平板稀释法测定其对万古霉素（VAN），红霉素（ERY），氯霉素（CHL），四环素（TET），恩诺沙星（ENR），氟苯尼考（FFC），氨苄西林（AMP），青霉素（PEN）等抗菌药物的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）检测其对高浓度庆大霉素（high-level gentamicin resistance，HLGR），高浓度链霉素（high-level streptomycin resistance，HLSR）的耐受情况。为保证试验的准确性，所有菌株的最小抑菌浓度测定重复两次。质控菌株（quality control，QC）ATCC29212的MIC范围及抗菌药物的耐药折点如表1所示。多药耐药菌株（mutidrug resistant，MDR）定义为至少对三类抗菌药物耐受的菌株[5]。
表1 质控菌MIC范围，抗菌药物测定范围及平板稀释法下抗菌药物敏感性测试耐药折点
抗菌药物 质控菌MIC范围b 测定范围 MICa折点（μg mL-1）c
敏感 中介 耐药
青霉素 1-4 0.25-128 ≤8 - ≥16
氨苄西林 0.5-2 0.0625-128 ≤8 - ≥16
仔猪1-2 15 12
仔猪2-1 18 14
仔猪2-2 14 14
仔猪3-1 2 12
仔猪3-2 15 14
仔猪4-1 15 13
仔猪4-2 0 14
[4] Kos, V.N., et al., Comparative genomics of vancomycin-resistant Staphylococcus aureus strains and their positions within the clade most commonly associated with methicillin-resistant S. aureus hospital-acquired infection in the United States. MBio, 2012. 3(3): p. e00112-12.
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