非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白对口蹄疫病毒的免疫增强效果研究
：目前针对口蹄疫的有效防止手段是接种灭活疫苗，但是灭活苗免疫性差，抗体产生慢、抗体水平低、抗体持续期短。为了寻求开发一种安全高效、无毒副作用、稳定性好、价格低廉的口蹄疫疫苗佐剂，本实验通过选用具有良好佐剂活性的非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白为载体，构建嵌合免疫原，以口蹄疫病毒为检测靶标，通过6-8周龄BALB/C小鼠接种实验，检测血清中IgG和粪便中IgA滴度，通过无佐剂、H0、H0-LTMT、H0(n+c)、H0(n+c)-LTMT作为佐剂对照分析比较非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白对口蹄疫病毒的免疫增强效果。实验结果表明鞭毛重组蛋白对口蹄疫灭活疫苗都有较强的免疫增强作用；全长鞭毛蛋白（H0）和去除高变区鞭毛蛋白（H0-(n+c)）的免疫增强效果差异不显著；而H0(n+c)-LTMT的免疫增强作用优于H0-LTMT，免疫增强效果最为显著。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 菌株和载体 2
1.1.2 试剂和溶液 2
1.1.3 仪器 2
1.1.4 实验动物 2
1.2 方法 2
1.2.1 基因克隆2
1.2.2 细菌的转化3
1.2.3 菌落的阳性鉴定3
1.2.4 重组蛋白的诱导表达3
1.2.5 重组蛋白的鉴定4
1.2.6 重组蛋白的纯化4
1.2.7 多克隆抗体的制备4
1.2.8 抗体效价测定5
2 结果与分析7
2.1 重组蛋白的构建7
2.2 重组蛋白的表达与纯化7
2.3 重组蛋白的免疫效果9
3 讨论 9
致谢11
参考文献11
非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白对口蹄疫病毒的免疫增强效果的研究
引言
口蹄疫(Footandmouth disease.FMD)是由口蹄疫病毒引起的偶蹄兽急性、热性、高度接触性传染病[]。该病以传播速度
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
快、流行范围广、感染率高为特征。易感动物主要有猪、牛、羊等家畜及其他家养和野生偶蹄动物[]。FMD也可感染人，但病例很少，表现轻微。FMD的发病率为100%，病死率因毒株而异，严重时可达100%[]。该病对社会及经济贸易危害严重，被世界动物卫生组织（OIE）列为A类动物传染病[]。
口蹄疫病毒血清型全世界有A、O、C、亚洲1型(Asia 1)、南非1 (SATI)、南非2 (SAT H ) 和南非3 (SAT m ) 7种，在传播感染过程中又形成60多个亚型。近几年，由于O型病毒所衍生的泛亚株逐渐增多，与原型相比，其传播和感染能力有了很大的提高，从而使其比其他毒株更具竞争优势[]。
目前疫苗接种仍然是口蹄疫最主要且有效的防治手段，灭活疫苗因为安全可靠、免疫效果良好、免疫动物后没有变态反应，而成为使用最普遍的疫苗；但是灭活苗免疫性差，抗体产生慢、抗体水平低、抗体持续期短。随着现代分子生物学技术的发展，口蹄疫疫苗的研制不断得到改进，在借鉴传统疫苗研究的基础上，寻求开发一种安全高效、无毒副作用、稳定性好、价格低廉的口蹄疫疫苗佐剂是本次研究的主要内容[]。
鞭毛蛋白（flagellin, FliC）是鞭毛的主要结构蛋白，是TLR5的刺激剂[]。FliC N端和C端高度保守，存在于鞭毛丝的轴心，是鞭毛发挥佐剂活性的重要部位，能与TLR5结合激活天然免疫，具有作为分子内佐剂携带外源表位成为疫苗的潜能，以及与病毒表位融合制备重组蛋白疫苗的潜能；而中间区域暴露于鞭毛表面，在长度和组成上呈现高度变化，形成不同的抗原表位，这个区域被称为“高变区”。全部或部分缺失鞭毛蛋白高变区会使鞭毛的抗原性降低，但不会影响其佐剂活性[]。鉴于高变区可容许部分区域的缺失和外源多肽插入，基于此建立的鞭毛表面展示技术被广泛地运用于构建新型活疫苗的研究[]。
本实验针对口蹄疫病毒灭活疫苗抗体产生慢，抗体水平低的现状，体外表达非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白（H0），作为佐剂添加到灭活疫苗中，以期提高免疫应答反应[]。同时以H0为主要骨架，串联佐剂蛋白LTMT，获得多价重组蛋白H0LTMT，进一步评估对口蹄疫灭活疫苗的免疫增强效果。 68周龄BALB/C小鼠为接种对象，血清中IgG和粪便中IgA滴度最为主要评价指标，对比分析口蹄疫病毒与重组蛋白混合免疫原的免疫效果。结果显示：多个重组鞭毛蛋白对口蹄疫灭活疫苗都有较强的免疫增强作用。全长鞭毛蛋白（H0）和去除高变区鞭毛蛋白（H0(n+c)）的免疫增强效果差异不显著；而H0(n+c)LTMT的免疫增强作用优于H0LTMT，免疫增强效果最为显著。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 菌株和载体 Pcold I、Pcold IH0、Pcold IH0(n+c)、pUC57LTMT均为本室保存。
1．1．2 试剂和溶液 限制性内切酶、T4 DNA连接酶，均为TaKaRa公司产品；质粒提取试剂盒，DNA凝胶回收试剂盒，蛋白浓度检测试剂盒为Axygen产品；酵母抽提物、蛋白胨购自美国Oxoid公司。
1．1．3 实验动物 68周龄BALB/C小鼠，购于扬州大学医学院。
1．2 方法
1．2．1 基因克隆 重组质粒pUC57LTMT经过EcoRI和SalI酶切，1%琼脂糖凝胶电泳分析，切胶回收目的片段。
在紫外灯下切取目的条带，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎，计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积；加入3个凝胶体积的Buffer DEA(500ul)，混合均匀后于75℃水浴至胶块完全熔化；加入1/2个的Buffer DEA的Buffer DEB(250ul)，混合均匀；吸取上一步骤的混合液转移到DNA制备管（置于2ml离心管中），12000g离心1min，弃滤液；将制备管置回2ml离心管，加500ul Buffer W1,12000g离心30s，弃滤液；将制备管置回2ml离心管，加700ul Buffer W2,12000g离心30s，弃滤液，并重复该步骤一次；将制备管置回2ml离心管，12000g离心1min；将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备膜中央加2530ul Eluent或者去离子水，室温静置1min，12000g离心1min洗脱DNA。
然后按以下连接体系进行连接：
目的片段 10ul
表达载体 5ul
T4连接酶 1ul
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 菌株和载体 2
1.1.2 试剂和溶液 2
1.1.3 仪器 2
1.1.4 实验动物 2
1.2 方法 2
1.2.1 基因克隆2
1.2.2 细菌的转化3
1.2.3 菌落的阳性鉴定3
1.2.4 重组蛋白的诱导表达3
1.2.5 重组蛋白的鉴定4
1.2.6 重组蛋白的纯化4
1.2.7 多克隆抗体的制备4
1.2.8 抗体效价测定5
2 结果与分析7
2.1 重组蛋白的构建7
2.2 重组蛋白的表达与纯化7
2.3 重组蛋白的免疫效果9
3 讨论 9
致谢11
参考文献11
非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白对口蹄疫病毒的免疫增强效果的研究
引言
口蹄疫(Footandmouth disease.FMD)是由口蹄疫病毒引起的偶蹄兽急性、热性、高度接触性传染病[]。该病以传播速度
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
快、流行范围广、感染率高为特征。易感动物主要有猪、牛、羊等家畜及其他家养和野生偶蹄动物[]。FMD也可感染人，但病例很少，表现轻微。FMD的发病率为100%，病死率因毒株而异，严重时可达100%[]。该病对社会及经济贸易危害严重，被世界动物卫生组织（OIE）列为A类动物传染病[]。
口蹄疫病毒血清型全世界有A、O、C、亚洲1型(Asia 1)、南非1 (SATI)、南非2 (SAT H ) 和南非3 (SAT m ) 7种，在传播感染过程中又形成60多个亚型。近几年，由于O型病毒所衍生的泛亚株逐渐增多，与原型相比，其传播和感染能力有了很大的提高，从而使其比其他毒株更具竞争优势[]。
目前疫苗接种仍然是口蹄疫最主要且有效的防治手段，灭活疫苗因为安全可靠、免疫效果良好、免疫动物后没有变态反应，而成为使用最普遍的疫苗；但是灭活苗免疫性差，抗体产生慢、抗体水平低、抗体持续期短。随着现代分子生物学技术的发展，口蹄疫疫苗的研制不断得到改进，在借鉴传统疫苗研究的基础上，寻求开发一种安全高效、无毒副作用、稳定性好、价格低廉的口蹄疫疫苗佐剂是本次研究的主要内容[]。
鞭毛蛋白（flagellin, FliC）是鞭毛的主要结构蛋白，是TLR5的刺激剂[]。FliC N端和C端高度保守，存在于鞭毛丝的轴心，是鞭毛发挥佐剂活性的重要部位，能与TLR5结合激活天然免疫，具有作为分子内佐剂携带外源表位成为疫苗的潜能，以及与病毒表位融合制备重组蛋白疫苗的潜能；而中间区域暴露于鞭毛表面，在长度和组成上呈现高度变化，形成不同的抗原表位，这个区域被称为“高变区”。全部或部分缺失鞭毛蛋白高变区会使鞭毛的抗原性降低，但不会影响其佐剂活性[]。鉴于高变区可容许部分区域的缺失和外源多肽插入，基于此建立的鞭毛表面展示技术被广泛地运用于构建新型活疫苗的研究[]。
本实验针对口蹄疫病毒灭活疫苗抗体产生慢，抗体水平低的现状，体外表达非致病性大肠杆菌鞭毛蛋白（H0），作为佐剂添加到灭活疫苗中，以期提高免疫应答反应[]。同时以H0为主要骨架，串联佐剂蛋白LTMT，获得多价重组蛋白H0LTMT，进一步评估对口蹄疫灭活疫苗的免疫增强效果。 68周龄BALB/C小鼠为接种对象，血清中IgG和粪便中IgA滴度最为主要评价指标，对比分析口蹄疫病毒与重组蛋白混合免疫原的免疫效果。结果显示：多个重组鞭毛蛋白对口蹄疫灭活疫苗都有较强的免疫增强作用。全长鞭毛蛋白（H0）和去除高变区鞭毛蛋白（H0(n+c)）的免疫增强效果差异不显著；而H0(n+c)LTMT的免疫增强作用优于H0LTMT，免疫增强效果最为显著。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 菌株和载体 Pcold I、Pcold IH0、Pcold IH0(n+c)、pUC57LTMT均为本室保存。
1．1．2 试剂和溶液 限制性内切酶、T4 DNA连接酶，均为TaKaRa公司产品；质粒提取试剂盒，DNA凝胶回收试剂盒，蛋白浓度检测试剂盒为Axygen产品；酵母抽提物、蛋白胨购自美国Oxoid公司。
1．1．3 实验动物 68周龄BALB/C小鼠，购于扬州大学医学院。
1．2 方法
1．2．1 基因克隆 重组质粒pUC57LTMT经过EcoRI和SalI酶切，1%琼脂糖凝胶电泳分析，切胶回收目的片段。
在紫外灯下切取目的条带，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎，计算凝胶重量，该重量作为一个凝胶体积；加入3个凝胶体积的Buffer DEA(500ul)，混合均匀后于75℃水浴至胶块完全熔化；加入1/2个的Buffer DEA的Buffer DEB(250ul)，混合均匀；吸取上一步骤的混合液转移到DNA制备管（置于2ml离心管中），12000g离心1min，弃滤液；将制备管置回2ml离心管，加500ul Buffer W1,12000g离心30s，弃滤液；将制备管置回2ml离心管，加700ul Buffer W2,12000g离心30s，弃滤液，并重复该步骤一次；将制备管置回2ml离心管，12000g离心1min；将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备膜中央加2530ul Eluent或者去离子水，室温静置1min，12000g离心1min洗脱DNA。
然后按以下连接体系进行连接：
目的片段 10ul
表达载体 5ul
T4连接酶 1ul
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