不同碳源对一株厌氧真菌发酵特性的影响
不同碳源对一株厌氧真菌发酵特性的影响[20200510204452]
摘要：【目的】本文比较研究了厌氧真菌分别利用五碳糖和六碳糖的发酵特性，以期更好的了解厌氧真菌对这两种碳源的利用及代谢情况。【方法】本文分别以葡萄糖和木糖为底物，厌氧真菌Piromyces sp. F1为接种物，厌氧培养96小时。利用气压转换仪和气相色谱仪在不同时间点测定产气量、氢气浓度和发酵液中的乙酸浓度。【结果】葡萄糖组的生长延滞期比木糖组的短，累积产气速度和氢气生成速度也比木糖组快。相同时间点的总产气量和氢气产量葡萄糖组显著高于木糖组（P<0.05）。48小时和72小时葡萄糖组发酵液中乙酸含量显著高于木糖组（P<0.05）。【结论】厌氧真菌利用葡萄糖的发酵效率高于木糖。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
关键字:厌氧真菌；葡萄糖；木糖；代谢
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1培养基的成份及其配制2
1.1.2菌种来源2
1.2方法 2
1.2.1发酵试验设计2
1.2.2总产气量测定3
1.2.3 氢气的测定3
1.2.4乙酸的测定3
1.3主要试剂和仪器3
1.4数据处理3
2结果与分析3
2.1厌氧真菌的发酵结果3
2.1.1 产气量3
2.1.2 乙酸生成情况4
3讨论 5
参考文献6
不同碳源对一株厌氧真菌发酵特性的影响
引言
引言
评估厌氧真菌的生长情况，通常有干物质消失率测定法和发酵产物定量分析法，但这些方法在采样时都要干扰菌株发酵和生长过程。1995年Theodorou等[1]首次成功地利用该方法研究了厌氧真菌的发酵产气规律。2001年朱伟云等[2]，用此方法首次大规模比较了来自不同地区不同动物的30株厌氧真菌的发酵特性，结果表明，厌氧真菌的来源动物及地区性能影响这些菌降解植物片段的能力，动物采食的饲料种类也有一定的影响。气压转换技术，主要是利用气压转换仪，定时测定不同时间点发酵瓶中的气压和产气量。经数学模型处理，即可对厌氧真菌菌株进行生长动力学分析，又能够为评估厌氧真菌降解底物的能力提供依据。
自从1975年，Orpin首次证实了厌氧真菌的存在以来，国内外学者已从草食动物的消化道中分离出多种厌氧真菌，目前已发现六个属总 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
计20多个种[3]。厌氧真菌在反刍动物降解纤维过程中扮演着非常重要的角色，其利用假根系统刺穿植物细胞壁组织，并产生一系列细胞壁降解酶从而将纤维素逐步降解。厌氧真菌能发酵利用的底物范围很广，如纤维素、木聚糖、葡聚糖等植物细胞壁结构性多糖，也有淀粉、糖原等贮存性多糖，还有葡萄糖、果糖、纤维二糖、乳糖、麦芽糖和蔗糖等单糖及寡糖[4-5]。厌氧真菌进行混合酸发酵产生甲酸、乙酸、乳酸、乙醇、琥珀酸、H2和CO2[6]。厌氧真菌的代谢受底物的影响很大。已有研究发现厌氧真菌利用不同碳源的代谢产物基本相同，主要为甲酸、乙酸、乙醇、乳酸、CO2和H2[6-7]，但底物不同各产物的比例会发生变化。Neocallimastix hurleyensis体外发酵木糖的代谢产物以甲酸为主，而发酵葡萄糖时以乙酸为主。Neocallimastix patriciarum发酵纤维二糖时产生的甲酸和乙醇很少。当以纤维素为底物时，N. frontalis和Piromyces sp. E2均产生大量的甲酸和乙醇[8-9]。Boxma等[9]发现Piromyces sp. E2以0.3%的果糖为底物发酵时：35%的碳源在细胞质中降解成乙醇、甲酸、乳酸和琥珀酸，65%的碳源在氢酶体中降解成乙酸和甲酸。本试验以葡萄糖和木糖为底物，体外发酵96小时，旨在研究厌氧真菌利用不同碳源的发酵特性，以期更好的了解厌氧真菌对不同碳源的利用情况。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 培养基成分及其配制
本试验所用培养基参照Barichevich ( 1990 )的方法配制。向细颈瓶中依次加入文献中的溶液和溶质，然后加热至沸腾。接着向细颈瓶中通入CO2，4-5小时后调节pH至6.8，再加入L-半胱氨酸盐酸盐，等到培养基变为浅黄色后进行培养基的分装。分装时血清瓶中通入半分钟的CO2以排除空气，分装完毕迅速加盖异丁基塑胶塞，并以银盖密封，灭菌(115°C，20min)。发酵底物分别为葡萄糖和木糖。
1.1.2 菌种来源
试验菌种采用本实验室从本地山羊瘤胃液中分离得到的厌氧真菌Piromyces sp. F1[10]。实验前将菌种复活后进行滚管纯化3-4次，确保其活性及纯度。
1．2 方法
1.2.1 发酵试验设计
试验分别以葡萄糖（P组）和木糖（M组）为底物进行发酵。每个组设6个重复并设空白对照。接种前半天前先将维生素和青链霉素加入培养基（培养基中抗生素的浓度为：青霉素，1600 U/mL；链霉素，2000 U/mL）。然后将培养基置于39℃培养箱预热；接种结束后，用气压转换仪 ( IGER，UK ) 平衡发酵瓶内气压，使初始气压与大气压平衡，39℃静置培养。分别于相应时间点测定产气量和氢气产量。于相应采样点测定pH值，并取上清液于-20℃保存，以备测相应指标。1.2.2 总产气量的测定
总产物量的测定参照 Theodorou 等[1]的方法，于8 h、16h、24 h、32 h、40 h、48 h、56 h、64 h、72 h、80h和96 h测定发酵瓶内产气量。注意全程无菌操作，对气压转换器的针头和操作桌面用75%的酒精消毒，并对每组发酵瓶瓶盖用75%的酒精消毒。将各时间点的产气量相加得到累计产气量。
1.2.3 氢气的测定
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氢气的测定采用气相色谱法。所用仪器为：GC-7890B型气相色谱仪（美国安捷伦）。于8 h、16h、24 h、32 h、40 h、48 h、56 h、64 h、72 h、80h和96 h测定发酵瓶内氢气产量。测定氢气产气量时，要对进样针和操作桌面用75%的酒精消毒，并对每组发酵瓶瓶盖也进行消毒。将各时间点的甲烷产量相加得到累计氢气产量。
1.2.4 乙酸的测定
利用毛细管气相色谱检测。样品测定前，取1 mL的发酵液到离心管中，再加入0.2 mL的25 %（w/v）偏磷酸巴豆酸混合溶液，巴豆酸作内标，-20 ℃保存，用前12000 rpm离心10 min，重复两次，取上清。色谱条件：色谱柱采用毛细吸管柱，柱温115 ℃，汽化温度200℃，采用氢离子火焰检测器，检测温度200 ℃，载气为氮气。
1.3主要试剂和仪器
GC-7890B型气相色谱仪(美国安捷伦)，厌氧滚管，气压转换器( IGER，UK )，隔水式恒温培养箱，厌氧分装系统，青链霉素粉剂。
1.4数据处理
数据经Excel 2007 初步处理后，利用SPSS(20.0)进行统计分析，采用独立样本t检验进行均值比较，置信区间为95%。数据以6个重复的平均值±标准误的形式表示。
2 结果与分析
2．1 厌氧真菌的发酵结果
2．1．1 产气量
如图1所示，厌氧真菌Piromyces sp. F1以葡萄糖为底物发酵时的生长延滞期比以木糖为底物时短。以葡萄糖为底物发酵的产气量曲线呈现较好的“S”型曲线，在24-56小时，产气速率较快，在60小时后，产气量逐渐减小并趋于平稳。而以木糖为底物的产气量曲线呈现出较平缓的“S”型曲线，在80小时后仍有气体产生。对比两条发酵曲线，每个时间点的总产气量，葡萄糖组均高于木糖组。
如图2所示，厌氧真菌Piromyces sp. F1发酵木糖和葡萄糖产生氢气的时间曲线与产气量曲线趋势相似。每个时间点的氢气累积产量，葡萄糖组均高于木糖组。
摘要：【目的】本文比较研究了厌氧真菌分别利用五碳糖和六碳糖的发酵特性，以期更好的了解厌氧真菌对这两种碳源的利用及代谢情况。【方法】本文分别以葡萄糖和木糖为底物，厌氧真菌Piromyces sp. F1为接种物，厌氧培养96小时。利用气压转换仪和气相色谱仪在不同时间点测定产气量、氢气浓度和发酵液中的乙酸浓度。【结果】葡萄糖组的生长延滞期比木糖组的短，累积产气速度和氢气生成速度也比木糖组快。相同时间点的总产气量和氢气产量葡萄糖组显著高于木糖组（P<0.05）。48小时和72小时葡萄糖组发酵液中乙酸含量显著高于木糖组（P<0.05）。【结论】厌氧真菌利用葡萄糖的发酵效率高于木糖。
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关键字:厌氧真菌；葡萄糖；木糖；代谢
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1培养基的成份及其配制2
1.1.2菌种来源2
1.2方法 2
1.2.1发酵试验设计2
1.2.2总产气量测定3
1.2.3 氢气的测定3
1.2.4乙酸的测定3
1.3主要试剂和仪器3
1.4数据处理3
2结果与分析3
2.1厌氧真菌的发酵结果3
2.1.1 产气量3
2.1.2 乙酸生成情况4
3讨论 5
参考文献6
不同碳源对一株厌氧真菌发酵特性的影响
引言
引言
评估厌氧真菌的生长情况，通常有干物质消失率测定法和发酵产物定量分析法，但这些方法在采样时都要干扰菌株发酵和生长过程。1995年Theodorou等[1]首次成功地利用该方法研究了厌氧真菌的发酵产气规律。2001年朱伟云等[2]，用此方法首次大规模比较了来自不同地区不同动物的30株厌氧真菌的发酵特性，结果表明，厌氧真菌的来源动物及地区性能影响这些菌降解植物片段的能力，动物采食的饲料种类也有一定的影响。气压转换技术，主要是利用气压转换仪，定时测定不同时间点发酵瓶中的气压和产气量。经数学模型处理，即可对厌氧真菌菌株进行生长动力学分析，又能够为评估厌氧真菌降解底物的能力提供依据。
自从1975年，Orpin首次证实了厌氧真菌的存在以来，国内外学者已从草食动物的消化道中分离出多种厌氧真菌，目前已发现六个属总 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
计20多个种[3]。厌氧真菌在反刍动物降解纤维过程中扮演着非常重要的角色，其利用假根系统刺穿植物细胞壁组织，并产生一系列细胞壁降解酶从而将纤维素逐步降解。厌氧真菌能发酵利用的底物范围很广，如纤维素、木聚糖、葡聚糖等植物细胞壁结构性多糖，也有淀粉、糖原等贮存性多糖，还有葡萄糖、果糖、纤维二糖、乳糖、麦芽糖和蔗糖等单糖及寡糖[4-5]。厌氧真菌进行混合酸发酵产生甲酸、乙酸、乳酸、乙醇、琥珀酸、H2和CO2[6]。厌氧真菌的代谢受底物的影响很大。已有研究发现厌氧真菌利用不同碳源的代谢产物基本相同，主要为甲酸、乙酸、乙醇、乳酸、CO2和H2[6-7]，但底物不同各产物的比例会发生变化。Neocallimastix hurleyensis体外发酵木糖的代谢产物以甲酸为主，而发酵葡萄糖时以乙酸为主。Neocallimastix patriciarum发酵纤维二糖时产生的甲酸和乙醇很少。当以纤维素为底物时，N. frontalis和Piromyces sp. E2均产生大量的甲酸和乙醇[8-9]。Boxma等[9]发现Piromyces sp. E2以0.3%的果糖为底物发酵时：35%的碳源在细胞质中降解成乙醇、甲酸、乳酸和琥珀酸，65%的碳源在氢酶体中降解成乙酸和甲酸。本试验以葡萄糖和木糖为底物，体外发酵96小时，旨在研究厌氧真菌利用不同碳源的发酵特性，以期更好的了解厌氧真菌对不同碳源的利用情况。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 培养基成分及其配制
本试验所用培养基参照Barichevich ( 1990 )的方法配制。向细颈瓶中依次加入文献中的溶液和溶质，然后加热至沸腾。接着向细颈瓶中通入CO2，4-5小时后调节pH至6.8，再加入L-半胱氨酸盐酸盐，等到培养基变为浅黄色后进行培养基的分装。分装时血清瓶中通入半分钟的CO2以排除空气，分装完毕迅速加盖异丁基塑胶塞，并以银盖密封，灭菌(115°C，20min)。发酵底物分别为葡萄糖和木糖。
1.1.2 菌种来源
试验菌种采用本实验室从本地山羊瘤胃液中分离得到的厌氧真菌Piromyces sp. F1[10]。实验前将菌种复活后进行滚管纯化3-4次，确保其活性及纯度。
1．2 方法
1.2.1 发酵试验设计
试验分别以葡萄糖（P组）和木糖（M组）为底物进行发酵。每个组设6个重复并设空白对照。接种前半天前先将维生素和青链霉素加入培养基（培养基中抗生素的浓度为：青霉素，1600 U/mL；链霉素，2000 U/mL）。然后将培养基置于39℃培养箱预热；接种结束后，用气压转换仪 ( IGER，UK ) 平衡发酵瓶内气压，使初始气压与大气压平衡，39℃静置培养。分别于相应时间点测定产气量和氢气产量。于相应采样点测定pH值，并取上清液于-20℃保存，以备测相应指标。1.2.2 总产气量的测定
总产物量的测定参照 Theodorou 等[1]的方法，于8 h、16h、24 h、32 h、40 h、48 h、56 h、64 h、72 h、80h和96 h测定发酵瓶内产气量。注意全程无菌操作，对气压转换器的针头和操作桌面用75%的酒精消毒，并对每组发酵瓶瓶盖用75%的酒精消毒。将各时间点的产气量相加得到累计产气量。
1.2.3 氢气的测定
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
氢气的测定采用气相色谱法。所用仪器为：GC-7890B型气相色谱仪（美国安捷伦）。于8 h、16h、24 h、32 h、40 h、48 h、56 h、64 h、72 h、80h和96 h测定发酵瓶内氢气产量。测定氢气产气量时，要对进样针和操作桌面用75%的酒精消毒，并对每组发酵瓶瓶盖也进行消毒。将各时间点的甲烷产量相加得到累计氢气产量。
1.2.4 乙酸的测定
利用毛细管气相色谱检测。样品测定前，取1 mL的发酵液到离心管中，再加入0.2 mL的25 %（w/v）偏磷酸巴豆酸混合溶液，巴豆酸作内标，-20 ℃保存，用前12000 rpm离心10 min，重复两次，取上清。色谱条件：色谱柱采用毛细吸管柱，柱温115 ℃，汽化温度200℃，采用氢离子火焰检测器，检测温度200 ℃，载气为氮气。
1.3主要试剂和仪器
GC-7890B型气相色谱仪(美国安捷伦)，厌氧滚管，气压转换器( IGER，UK )，隔水式恒温培养箱，厌氧分装系统，青链霉素粉剂。
1.4数据处理
数据经Excel 2007 初步处理后，利用SPSS(20.0)进行统计分析，采用独立样本t检验进行均值比较，置信区间为95%。数据以6个重复的平均值±标准误的形式表示。
2 结果与分析
2．1 厌氧真菌的发酵结果
2．1．1 产气量
如图1所示，厌氧真菌Piromyces sp. F1以葡萄糖为底物发酵时的生长延滞期比以木糖为底物时短。以葡萄糖为底物发酵的产气量曲线呈现较好的“S”型曲线，在24-56小时，产气速率较快，在60小时后，产气量逐渐减小并趋于平稳。而以木糖为底物的产气量曲线呈现出较平缓的“S”型曲线，在80小时后仍有气体产生。对比两条发酵曲线，每个时间点的总产气量，葡萄糖组均高于木糖组。
如图2所示，厌氧真菌Piromyces sp. F1发酵木糖和葡萄糖产生氢气的时间曲线与产气量曲线趋势相似。每个时间点的氢气累积产量，葡萄糖组均高于木糖组。
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