禽致病性大肠杆菌DE205BireA基因缺失株的构建及功能分析
禽致病性大肠杆菌DE205BireA基因缺失株的构建及功能分析[20200507184436]
摘要：禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic E.coli, APEC)可引起鸡、鸭、火鸡等禽类的大肠杆菌病。有研究表明ireA基因在尿道致病性大肠杆菌(Uropathogenic E.coli,UPEC)中与摄铁相关，但在禽致病性大肠杆菌中的功能尚未证实。本试验利用Red同源重组系统，构建禽致病性大肠杆菌DE205B的ireA基因缺失株DE205B-IK。小鼠攻毒试验表明，缺失株与野生株的毒力不存在显著差异。用荧光定量PCR的方法检测DE205B与DE205B-IK的摄铁相关基因irp1、irp2、fepA、fepC、ChuA、ChuT、FeoB、fyuA的表达水平，结果显示，缺失株DE205B-IK的irp1、fepA、ChuA、ChuT、FeoB、fyuA等基因表达量显著上升，表明ireA基因确实参与禽致病性大肠杆菌DE205B摄铁相关功能。还进行了ireA基因的分布调查，在190株被检大肠杆菌菌株中，61株呈ireA阳性（32.11%），在B2群和D群中分布较多，推测ireA基因可能与禽致病性大肠杆菌的毒力相关。
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关键字:禽致病性大肠杆菌,ireA基因,缺失,摄铁因子
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1菌株和质粒2
1.2试验设计2
1.3引物设计2
1.4 ireA基因在大肠杆菌中的分布调查3
1.5 DE205B ireA基因缺失株的构建3
1.5.1融合PCR产物的制备及纯化3
1.5.2 感受态的制备及转化3
1.5.3 交叉PCR鉴定4
1.5.4 PKD46质粒的去除 4
1.5.5 卡那霉素抗性的去除4
1.6 动物感染试验4
1.6.1 菌株的复壮4
1.6.2 小鼠感染试验 4
1.7 细菌RNA提取及摄铁系统相关因子表达量的检测5
1.7.1细菌RNA的提取5
1.7.2 cDNA的合成5
1.7.3 荧光定量PCR5
2 结果与分析5
2.1 ireA基因在大肠杆菌中的分布情况5
2.2 ireA基因缺失株的构建与鉴定8
2.2.1 电转化与鉴定8
2.2.2 质粒pkD46的去除9
2.2.3 卡那抗性的去除9
2.3 动物感染试验10
2.3.1 菌株的复壮10
2.3.2 小鼠感染试验 11
2.4 荧光定量PCR11
3 讨论12
致谢13
参考文献14
禽致病性大肠杆菌DE205B ireA基因缺失株的构建及功能分析
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> 引言
大肠杆菌是1885 年由德国科学家Escherich发现的，此后大肠杆菌即用这位发现者的名字命名[1]。大部分大肠杆菌属于哺乳动物和禽类肠道内的正常菌群，少数大肠杆菌具有致病性，称之为致病性大肠杆菌 (Pathogenic E.coli)。根据毒力因子、发病机制及病变的不同，大肠杆菌可分为肠道致病性大肠杆菌(Intestinal Pathogenic E.coli)和肠道外致病性大肠杆菌(Extraintestinal Pathogenic E.coli，ExPEC)[2]。肠道外致病性大肠杆菌包括尿道致病性大肠杆菌(Uropathogenic E.coli，UPEC)、新生儿脑膜炎大肠杆菌(Nconatalmeningitis E.coli，NMEC)和禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic E.coli，APEC)。其中，禽致病性大肠杆菌可引起鸡、鸭、火鸡及其他禽类发病，该病常表现为大肠杆菌性败血症、气囊炎、肝周炎、心包炎、脐炎、腹膜炎脑炎等病征。1894年 ligniers首次报道了鸡大肠杆菌病，随后世界许多国家和地区逐渐有了关于该病不同病型的报道[3]。该病是 2至 12周龄鸡或火鸡的一种常见传染病[4]， 一旦发生全身性系统感染，则很可能会给养禽业的带来毁灭性的经济损失[5]。有研究表明，禽源和人源大肠杆菌在基因组结构上很相似，且具有很高的同源性；在遗传进化和生态分布中也有较高相似性[6]，2010年，Tivendale 等[7]试验证明APEC也可引起包括人在内的哺乳动物疾病，表明 APEC亦是人兽共患病的潜在病原体。越来越多的证据显示 APEC对人类公共健康造成了更大的潜在威胁，因此对APEC的调查和研究，具有重大的现实意义。
禽致病性大肠杆菌有多种毒力因子，主要包括：菌毛黏附素和非菌毛黏附素，摄铁系统，溶血素，抗血清存活因子，毒素，侵袭素等[6]。其中，摄铁系统是较新发现的毒力因子，铁不仅是细菌必需的生长因子，而且对细菌毒力因子的表达也起调节作用。细菌生长需要的铁的浓度约为10-6mol/L。而正常体液中仅约10-18mol/L。多种细菌具备从宿主获取铁的能力,摄铁能力的大小决定着细菌的致病性[2]。ireA基因是摄铁系统中的成员。2001年，Russo等[8]在肠道外致病性大肠杆菌CP9中发现了ireA，并证明其编码了与铁摄取有关的毒力因子。国内外的研究表明，ireA基因在人源及动物源性大肠杆菌中都有分布[9,10,11,12]。提示对禽致病性大肠杆菌中ireA功能的分析研究，具有一定的流行病学及公共卫生学意义，但其在APEC中的功能尚未见报道。本实验室在前期研究中对一株血清型为O2的禽致病性大肠杆菌DE205B进行了全基因组测序，发现DE205B的一个基因岛上编码有ireA基因，本研究以禽致病性大肠杆菌DE205B为研究对象，通过基因缺失的方法，探究ireA基因在禽致病性大肠杆菌中的作用。
1 材料与方法
1.1 菌株和质粒
禽致病性大肠杆菌DE205B由本实验室分离保存，其他大肠杆菌菌株来源见表2，质粒pKD4、pKD46、pCP20，均由本实验室保存。
1.2 实验试剂
融合PCR产物的扩增使用PrimeSTAR HS DNA Polymerase with GC Buffe（Takara,DR04 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
4A）,2×Taq Master Mix（Vazyme）用于ireA基因的检测，质粒提取使用e.Z.N.A Plasmid MIni kit I 试剂盒(OMEGA，D6943-01),胶回收使用e.Z.N.A Gel Extraction Kit（D2500-02），PrimScript RT Master MIx（Takara,RR036A）用于反转录PCR，AceQ qPCR SYBR Green Master Mix(Vazyme，Q111-02)用于荧光定量PCR。
1.3 引物设计
以质粒pKD4为模板设计引物，扩增卡那霉素基因，并在引物的5端加60bp的ireA上下游基因(表1下划线部分)，作为同源重组的同源臂。引物ireA-up、ireA-down、K1、K2、Kt用于缺失株的鉴定，其中ireA-up、ireA-down为ireA开放性阅读框架上下游序列的引物，K1、K2和Kt是卡那霉素基因相关引物。根据DE205B的铁摄取相关基因序列设计荧光定量PCR引物。
表1 引物序列及用途
Table 1 Primer’s sequence and application
引物名称 序列 用途
ireA-p1 GTAAATTCCCTCTTTGCTAACGCAAATCATTATCATTACGCCTTTGGCAAAGGGAAATTT GTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGA PCR融合产物的扩增
ireA-p2 CATTACTGATTACTACACTGGTACCTGAGGCTCACGGCCTCAGGTTGTCTTTATATACTC CATATGAATATCCTCCTTAG
ireA-up TACTCCCCATCCCCGGGCAA 缺失株的交叉PCR检测 卡那霉素抗性的检测（K2/Kt）
ireA-down GGGGGCAGCAATATCCGGTG
K1 CAGTCATAGCCGAATAGCCT
摘要：禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic E.coli, APEC)可引起鸡、鸭、火鸡等禽类的大肠杆菌病。有研究表明ireA基因在尿道致病性大肠杆菌(Uropathogenic E.coli,UPEC)中与摄铁相关，但在禽致病性大肠杆菌中的功能尚未证实。本试验利用Red同源重组系统，构建禽致病性大肠杆菌DE205B的ireA基因缺失株DE205B-IK。小鼠攻毒试验表明，缺失株与野生株的毒力不存在显著差异。用荧光定量PCR的方法检测DE205B与DE205B-IK的摄铁相关基因irp1、irp2、fepA、fepC、ChuA、ChuT、FeoB、fyuA的表达水平，结果显示，缺失株DE205B-IK的irp1、fepA、ChuA、ChuT、FeoB、fyuA等基因表达量显著上升，表明ireA基因确实参与禽致病性大肠杆菌DE205B摄铁相关功能。还进行了ireA基因的分布调查，在190株被检大肠杆菌菌株中，61株呈ireA阳性（32.11%），在B2群和D群中分布较多，推测ireA基因可能与禽致病性大肠杆菌的毒力相关。
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关键字:禽致病性大肠杆菌,ireA基因,缺失,摄铁因子
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1菌株和质粒2
1.2试验设计2
1.3引物设计2
1.4 ireA基因在大肠杆菌中的分布调查3
1.5 DE205B ireA基因缺失株的构建3
1.5.1融合PCR产物的制备及纯化3
1.5.2 感受态的制备及转化3
1.5.3 交叉PCR鉴定4
1.5.4 PKD46质粒的去除 4
1.5.5 卡那霉素抗性的去除4
1.6 动物感染试验4
1.6.1 菌株的复壮4
1.6.2 小鼠感染试验 4
1.7 细菌RNA提取及摄铁系统相关因子表达量的检测5
1.7.1细菌RNA的提取5
1.7.2 cDNA的合成5
1.7.3 荧光定量PCR5
2 结果与分析5
2.1 ireA基因在大肠杆菌中的分布情况5
2.2 ireA基因缺失株的构建与鉴定8
2.2.1 电转化与鉴定8
2.2.2 质粒pkD46的去除9
2.2.3 卡那抗性的去除9
2.3 动物感染试验10
2.3.1 菌株的复壮10
2.3.2 小鼠感染试验 11
2.4 荧光定量PCR11
3 讨论12
致谢13
参考文献14
禽致病性大肠杆菌DE205B ireA基因缺失株的构建及功能分析
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
> 引言
大肠杆菌是1885 年由德国科学家Escherich发现的，此后大肠杆菌即用这位发现者的名字命名[1]。大部分大肠杆菌属于哺乳动物和禽类肠道内的正常菌群，少数大肠杆菌具有致病性，称之为致病性大肠杆菌 (Pathogenic E.coli)。根据毒力因子、发病机制及病变的不同，大肠杆菌可分为肠道致病性大肠杆菌(Intestinal Pathogenic E.coli)和肠道外致病性大肠杆菌(Extraintestinal Pathogenic E.coli，ExPEC)[2]。肠道外致病性大肠杆菌包括尿道致病性大肠杆菌(Uropathogenic E.coli，UPEC)、新生儿脑膜炎大肠杆菌(Nconatalmeningitis E.coli，NMEC)和禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic E.coli，APEC)。其中，禽致病性大肠杆菌可引起鸡、鸭、火鸡及其他禽类发病，该病常表现为大肠杆菌性败血症、气囊炎、肝周炎、心包炎、脐炎、腹膜炎脑炎等病征。1894年 ligniers首次报道了鸡大肠杆菌病，随后世界许多国家和地区逐渐有了关于该病不同病型的报道[3]。该病是 2至 12周龄鸡或火鸡的一种常见传染病[4]， 一旦发生全身性系统感染，则很可能会给养禽业的带来毁灭性的经济损失[5]。有研究表明，禽源和人源大肠杆菌在基因组结构上很相似，且具有很高的同源性；在遗传进化和生态分布中也有较高相似性[6]，2010年，Tivendale 等[7]试验证明APEC也可引起包括人在内的哺乳动物疾病，表明 APEC亦是人兽共患病的潜在病原体。越来越多的证据显示 APEC对人类公共健康造成了更大的潜在威胁，因此对APEC的调查和研究，具有重大的现实意义。
禽致病性大肠杆菌有多种毒力因子，主要包括：菌毛黏附素和非菌毛黏附素，摄铁系统，溶血素，抗血清存活因子，毒素，侵袭素等[6]。其中，摄铁系统是较新发现的毒力因子，铁不仅是细菌必需的生长因子，而且对细菌毒力因子的表达也起调节作用。细菌生长需要的铁的浓度约为10-6mol/L。而正常体液中仅约10-18mol/L。多种细菌具备从宿主获取铁的能力,摄铁能力的大小决定着细菌的致病性[2]。ireA基因是摄铁系统中的成员。2001年，Russo等[8]在肠道外致病性大肠杆菌CP9中发现了ireA，并证明其编码了与铁摄取有关的毒力因子。国内外的研究表明，ireA基因在人源及动物源性大肠杆菌中都有分布[9,10,11,12]。提示对禽致病性大肠杆菌中ireA功能的分析研究，具有一定的流行病学及公共卫生学意义，但其在APEC中的功能尚未见报道。本实验室在前期研究中对一株血清型为O2的禽致病性大肠杆菌DE205B进行了全基因组测序，发现DE205B的一个基因岛上编码有ireA基因，本研究以禽致病性大肠杆菌DE205B为研究对象，通过基因缺失的方法，探究ireA基因在禽致病性大肠杆菌中的作用。
1 材料与方法
1.1 菌株和质粒
禽致病性大肠杆菌DE205B由本实验室分离保存，其他大肠杆菌菌株来源见表2，质粒pKD4、pKD46、pCP20，均由本实验室保存。
1.2 实验试剂
融合PCR产物的扩增使用PrimeSTAR HS DNA Polymerase with GC Buffe（Takara,DR04 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
4A）,2×Taq Master Mix（Vazyme）用于ireA基因的检测，质粒提取使用e.Z.N.A Plasmid MIni kit I 试剂盒(OMEGA，D6943-01),胶回收使用e.Z.N.A Gel Extraction Kit（D2500-02），PrimScript RT Master MIx（Takara,RR036A）用于反转录PCR，AceQ qPCR SYBR Green Master Mix(Vazyme，Q111-02)用于荧光定量PCR。
1.3 引物设计
以质粒pKD4为模板设计引物，扩增卡那霉素基因，并在引物的5端加60bp的ireA上下游基因(表1下划线部分)，作为同源重组的同源臂。引物ireA-up、ireA-down、K1、K2、Kt用于缺失株的鉴定，其中ireA-up、ireA-down为ireA开放性阅读框架上下游序列的引物，K1、K2和Kt是卡那霉素基因相关引物。根据DE205B的铁摄取相关基因序列设计荧光定量PCR引物。
表1 引物序列及用途
Table 1 Primer’s sequence and application
引物名称 序列 用途
ireA-p1 GTAAATTCCCTCTTTGCTAACGCAAATCATTATCATTACGCCTTTGGCAAAGGGAAATTT GTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGA PCR融合产物的扩增
ireA-p2 CATTACTGATTACTACACTGGTACCTGAGGCTCACGGCCTCAGGTTGTCTTTATATACTC CATATGAATATCCTCCTTAG
ireA-up TACTCCCCATCCCCGGGCAA 缺失株的交叉PCR检测 卡那霉素抗性的检测（K2/Kt）
ireA-down GGGGGCAGCAATATCCGGTG
K1 CAGTCATAGCCGAATAGCCT
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