均一性黄芪中性多糖的制备和小鼠树突状细胞的分离培养
均一性黄芪中性多糖的制备和小鼠树突状细胞的分离培养[20200507190838]
摘要：黄芪多糖（Astragalus polysaccharides，APS）及其衍生物具有良好的体内外免疫增强作用，能提高动物的体液免疫和细胞免疫[1]。前期研究表明，黄芪多糖具有良好的免疫促进作用。树突状细胞（DCs），以其强大的专职性抗原提呈能力在免疫过程中发挥重要角色，是近年来研究的热点[2]。本课题在前期研究的基础上采用水提醇沉、三氯乙酸去蛋白、DEAE柱层析的方法制备均一性黄芪中性多糖，然后进行体外分离培养小鼠髓源树突状细胞，并采用倒置显微镜观察细胞的形态，为研究黄芪多糖的免疫增强活性打下良好的基础。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:黄芪多糖；树突状细胞；分离与培养
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言 1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2 方法 3
1.2.1精致黄芪多糖的制备3
1.2.1.1水提沉醇法提取黄芪多糖3
1.2.1.2三氯乙酸法除蛋白3
1.2.1.3过DEAE柱层析提纯3
1.2.2小鼠mBM-DCs的分离3
1.2.3 倒置显微镜观察细胞形态学的变化4
2 结果与分析 4
2.1 精致黄芪多糖的提取率4
2.2 黄芪多糖过柱的洗脱曲线4
2.3黄芪多糖对小鼠髓源树突状细胞的增殖结果4
3 讨论5
3.1 精致黄芪多糖制备中方法的选择5
3.1.1 多糖提取方法的选择5
3.1.2 多糖除蛋白方法的选择5
3.1.3多糖纯化方法的选择5
3.2树突状细胞分离培养的意义5
致谢5
参考文献6
均一性黄芪中性多糖的制备和小鼠树突状细胞的分离培养
引言
黄芪是一种常用的扶正中药,素以补气诸药之最著称,含有多糖、蛋白质、生物碱、氨基酸、黄酮类、微量元素等多种生物活性物质,其中多糖(Astragalus polysaccharides,APS)是黄芪中的主要生物活性成分之一,具有免疫调节、抗肿瘤、促进骨髓造血干细胞增殖和双向调节血糖等药理作用[6]。由于黄芪多糖的多种生物活性及良好的临床效果，近年来一直成为研究的热点之一。
抗原提呈细胞(antigen-present *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
ingeen cells,APCs)主要承担对抗原物质的摄取，加工，并将抗原肤呈递给特异性T淋巴细胞,是启动免疫应答的关键因素。树突状细胞(dendritic cells,DCs),是目前己知功能最强的专职APCs,具有诱导初次免疫应答的独特功能,能有效刺激初始型T细胞增殖,在机体细胞免疫和体液免疫调控中具有独特的地位。鉴于DCs在动物免疫过程中所处的重要地位，通过研究药物对于 DCs 功能的影响来探索免疫促进药物的开发与应用，有助于在细胞水平指导兽用免疫促进剂的研究和开发[7]。
药理研究表明，黄芪多糖是黄芪的活性成分之一，具有较强的免疫促进作用，能够有效促进动物体内体外多种免疫相关细胞增殖和免疫因子的释放，提高机体的细胞免疫和体液免疫，发挥良好的免疫佐剂作用[8]。为了研究黄芪多糖对DCs的药理作用，全面评价黄芪多糖的活性，我们采用小鼠骨髓源树突状细胞（mBM-CDs）为细胞模型，进行体外的分离培养，为后期探索黄芪多糖对DCs的作用打下良好的基础。
1 材料与方法
1.1 材料
精致黄芪多糖的制备：
药材：黄芪（购自丰原药业）。
试剂：乙醇、NaOH、三氯乙酸、DEAE、NaCl、硫酸、苯酚、Na2CO3、无水乙醇、浓硝酸、浓盐酸等；
器材：三颈瓶、离心管、烧杯、玻璃棒、层析柱，烧杯，试管（10mL、15mL）、三角瓶。
设备：旋转蒸发仪，电子称量仪、离心机、电热煲、超声波裂解仪、自动部分收集器，恒流泵、水浴锅。
小鼠髓源树突状细胞的培养：
实验动物：昆明种小鼠（清洁级）
实验器材：注射器1ml、5ml ，培养皿（10个），1000ml烧杯（4个），剪刀，镊子，EP管（80个左右，分装胎牛血清），玻璃离心管及配套的塞子，盐水瓶和配套瓶塞，吸管和胶头，酒精棉球，酒精灯，6孔细胞板（5枚），纱布，青霉素瓶（20个），胎牛血清，刺激因子（GM-CSF），汉克斯液，含10%胎牛血清的1640液，细胞培养箱，细胞计数板，倒置显微镜。
1.2 方法
1.2.1 精致黄芪多的制备
1.2.1.1 水提沉醇法提取黄芪多糖 取黄芪饮片在55℃鼓风干燥箱中干燥12h后粉碎，用6倍量95%乙醇浸泡过夜，水浴加热，回流三次，每次两小时，至回流液接近无色，药渣晾干，加入20倍水煎煮三次，每次两小时，合并滤液，浓缩至1000ml，离心去除杂质，缓慢加入95%乙醇至溶液含醇量为80%，边加边搅拌，静置过夜，抽滤，取沉淀，置烘箱烘干。
1.2.1.2 三氯乙酸法除蛋白 称取黄芪粗多糖，研碎，加水超声处理使之充分溶解，向该溶液中加入10%的氢氧化钠溶液调节PH至7中性，再加入3%的三氯乙酸使之占溶液浓度的7.5%， 再4℃下静置4小时，3000rpm离心20min，如此重复6次至茚三酮反应为阴性。取离心过后的多糖溶液，冻干，得到中性黄芪多糖。
1.2.1.3 过DEAE柱层析提纯 称取填料DEAE，用去离子水浸泡过夜，装柱。将黄芪多糖配成0.1g/ml的溶液，每次上样量为5ml。用蒸馏水通过恒流泵进入柱子洗脱多糖，并用自动收集仪收集多糖溶液，每5mL作为一个流份。采用苯酚-硫酸法测定糖含量，按照洗脱曲线进行合并，冻干， *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
得到均一性黄芪中性多糖。
1.2.2 小鼠mBM-DCs的分离与培养 小鼠脱颈法处死，浸入体积分数为75%的乙醇中5~10 min，无菌手术取出股骨胫骨、肱骨，剔除肌肉，磷酸盐缓冲液冲洗，剪去骨两端，反复冲洗出骨髓，直至骨变白，收入15 mL离心管中，离心（1500r/min，15min），弃上清，收集沉淀的骨髓细胞。以1∶10的体积比加入37℃预温的红细胞裂解液，反复吹打混匀，置室温2~4 min，除去红细胞。离心(1000r/min,5min)去上清,沉淀用PBS洗3遍后重悬于RPMI1640基础培养液,配成2×106个/mL细胞悬液,分装于六孔板中，5mL/瓶，放入37℃,5%CO2培养箱中培养。
1.2.3 倒置显微镜观察细胞形态学的变化 取步骤1.2.2中分离到的未成熟细胞，配成1×106个/mL，加入诱导剂（GM-CSF和IL-4）和生理盐水，培养细胞至第7天。第1、3、5天半量换液，每天倒置显微镜观察细胞培养过程中的形态学变化。
2 结果与分析
2.1 精致黄芪多糖的提取率
本次试验共取450.24g黄芪，经过第一次水提醇沉法得到粗多糖57.81g，粗多糖得率为12.84%。然后通过三氯乙酸法去除蛋白后收得多糖43.71g，计算得到多糖收率为9.71%。醇沉以后的黄芪多糖经去蛋白，再通过DEAE柱层析即可得到精制黄芪多糖，质量为32.1g ，精制多糖得率为7.13%。
2.2 黄芪多糖过柱的洗脱曲线
图1 黄芪多糖的DEAE柱洗脱曲线
由图1可见，黄芪粗多糖经过洗脱分为两个峰，根据曲线合并4-12管的多糖。
2.3 倒置显微镜物对细胞形态的观察
在培养的整个过程中,每天在倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。观察发现,骨髓细胞贴壁培养1d，除去未贴壁的细胞,更换含GM-CSF和IL-4的完全培养基后,可见细胞贴壁生长,呈均匀分布的细胞集落。细胞大小、形态均匀一致,有较好的折光度,无树枝样突起；第2天细胞疏松地贴附于板壁上呈簇状生长,形如葡萄串,但是细胞形态未见明显变化；第3天,细胞成簇生长,大多数细胞仍然贴壁,少数细胞处于半悬浮状态,细胞体积与原先接近,细胞核呈圆形或椭圆形较小,细胞周边可见细胞毛刺状突起,但毛刺较短；第4-5天,较多细胞呈半悬浮生长,可见大部分细胞呈梭型及不规则形状。细胞体积较以前增大,形态逐渐由圆形变为星形、梭形等不规则形状。培养到第6-7天,细胞体积较前增大,周边刺突十分明显,突起较粗大,分支较明显,细胞形态似星形或梭形,细胞核明显,细胞聚集生长,呈现典型的树突状细胞形态（图2）。
摘要：黄芪多糖（Astragalus polysaccharides，APS）及其衍生物具有良好的体内外免疫增强作用，能提高动物的体液免疫和细胞免疫[1]。前期研究表明，黄芪多糖具有良好的免疫促进作用。树突状细胞（DCs），以其强大的专职性抗原提呈能力在免疫过程中发挥重要角色，是近年来研究的热点[2]。本课题在前期研究的基础上采用水提醇沉、三氯乙酸去蛋白、DEAE柱层析的方法制备均一性黄芪中性多糖，然后进行体外分离培养小鼠髓源树突状细胞，并采用倒置显微镜观察细胞的形态，为研究黄芪多糖的免疫增强活性打下良好的基础。
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关键字:黄芪多糖；树突状细胞；分离与培养
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言 1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2 方法 3
1.2.1精致黄芪多糖的制备3
1.2.1.1水提沉醇法提取黄芪多糖3
1.2.1.2三氯乙酸法除蛋白3
1.2.1.3过DEAE柱层析提纯3
1.2.2小鼠mBM-DCs的分离3
1.2.3 倒置显微镜观察细胞形态学的变化4
2 结果与分析 4
2.1 精致黄芪多糖的提取率4
2.2 黄芪多糖过柱的洗脱曲线4
2.3黄芪多糖对小鼠髓源树突状细胞的增殖结果4
3 讨论5
3.1 精致黄芪多糖制备中方法的选择5
3.1.1 多糖提取方法的选择5
3.1.2 多糖除蛋白方法的选择5
3.1.3多糖纯化方法的选择5
3.2树突状细胞分离培养的意义5
致谢5
参考文献6
均一性黄芪中性多糖的制备和小鼠树突状细胞的分离培养
引言
黄芪是一种常用的扶正中药,素以补气诸药之最著称,含有多糖、蛋白质、生物碱、氨基酸、黄酮类、微量元素等多种生物活性物质,其中多糖(Astragalus polysaccharides,APS)是黄芪中的主要生物活性成分之一,具有免疫调节、抗肿瘤、促进骨髓造血干细胞增殖和双向调节血糖等药理作用[6]。由于黄芪多糖的多种生物活性及良好的临床效果，近年来一直成为研究的热点之一。
抗原提呈细胞(antigen-present *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
ingeen cells,APCs)主要承担对抗原物质的摄取，加工，并将抗原肤呈递给特异性T淋巴细胞,是启动免疫应答的关键因素。树突状细胞(dendritic cells,DCs),是目前己知功能最强的专职APCs,具有诱导初次免疫应答的独特功能,能有效刺激初始型T细胞增殖,在机体细胞免疫和体液免疫调控中具有独特的地位。鉴于DCs在动物免疫过程中所处的重要地位，通过研究药物对于 DCs 功能的影响来探索免疫促进药物的开发与应用，有助于在细胞水平指导兽用免疫促进剂的研究和开发[7]。
药理研究表明，黄芪多糖是黄芪的活性成分之一，具有较强的免疫促进作用，能够有效促进动物体内体外多种免疫相关细胞增殖和免疫因子的释放，提高机体的细胞免疫和体液免疫，发挥良好的免疫佐剂作用[8]。为了研究黄芪多糖对DCs的药理作用，全面评价黄芪多糖的活性，我们采用小鼠骨髓源树突状细胞（mBM-CDs）为细胞模型，进行体外的分离培养，为后期探索黄芪多糖对DCs的作用打下良好的基础。
1 材料与方法
1.1 材料
精致黄芪多糖的制备：
药材：黄芪（购自丰原药业）。
试剂：乙醇、NaOH、三氯乙酸、DEAE、NaCl、硫酸、苯酚、Na2CO3、无水乙醇、浓硝酸、浓盐酸等；
器材：三颈瓶、离心管、烧杯、玻璃棒、层析柱，烧杯，试管（10mL、15mL）、三角瓶。
设备：旋转蒸发仪，电子称量仪、离心机、电热煲、超声波裂解仪、自动部分收集器，恒流泵、水浴锅。
小鼠髓源树突状细胞的培养：
实验动物：昆明种小鼠（清洁级）
实验器材：注射器1ml、5ml ，培养皿（10个），1000ml烧杯（4个），剪刀，镊子，EP管（80个左右，分装胎牛血清），玻璃离心管及配套的塞子，盐水瓶和配套瓶塞，吸管和胶头，酒精棉球，酒精灯，6孔细胞板（5枚），纱布，青霉素瓶（20个），胎牛血清，刺激因子（GM-CSF），汉克斯液，含10%胎牛血清的1640液，细胞培养箱，细胞计数板，倒置显微镜。
1.2 方法
1.2.1 精致黄芪多的制备
1.2.1.1 水提沉醇法提取黄芪多糖 取黄芪饮片在55℃鼓风干燥箱中干燥12h后粉碎，用6倍量95%乙醇浸泡过夜，水浴加热，回流三次，每次两小时，至回流液接近无色，药渣晾干，加入20倍水煎煮三次，每次两小时，合并滤液，浓缩至1000ml，离心去除杂质，缓慢加入95%乙醇至溶液含醇量为80%，边加边搅拌，静置过夜，抽滤，取沉淀，置烘箱烘干。
1.2.1.2 三氯乙酸法除蛋白 称取黄芪粗多糖，研碎，加水超声处理使之充分溶解，向该溶液中加入10%的氢氧化钠溶液调节PH至7中性，再加入3%的三氯乙酸使之占溶液浓度的7.5%， 再4℃下静置4小时，3000rpm离心20min，如此重复6次至茚三酮反应为阴性。取离心过后的多糖溶液，冻干，得到中性黄芪多糖。
1.2.1.3 过DEAE柱层析提纯 称取填料DEAE，用去离子水浸泡过夜，装柱。将黄芪多糖配成0.1g/ml的溶液，每次上样量为5ml。用蒸馏水通过恒流泵进入柱子洗脱多糖，并用自动收集仪收集多糖溶液，每5mL作为一个流份。采用苯酚-硫酸法测定糖含量，按照洗脱曲线进行合并，冻干， *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
得到均一性黄芪中性多糖。
1.2.2 小鼠mBM-DCs的分离与培养 小鼠脱颈法处死，浸入体积分数为75%的乙醇中5~10 min，无菌手术取出股骨胫骨、肱骨，剔除肌肉，磷酸盐缓冲液冲洗，剪去骨两端，反复冲洗出骨髓，直至骨变白，收入15 mL离心管中，离心（1500r/min，15min），弃上清，收集沉淀的骨髓细胞。以1∶10的体积比加入37℃预温的红细胞裂解液，反复吹打混匀，置室温2~4 min，除去红细胞。离心(1000r/min,5min)去上清,沉淀用PBS洗3遍后重悬于RPMI1640基础培养液,配成2×106个/mL细胞悬液,分装于六孔板中，5mL/瓶，放入37℃,5%CO2培养箱中培养。
1.2.3 倒置显微镜观察细胞形态学的变化 取步骤1.2.2中分离到的未成熟细胞，配成1×106个/mL，加入诱导剂（GM-CSF和IL-4）和生理盐水，培养细胞至第7天。第1、3、5天半量换液，每天倒置显微镜观察细胞培养过程中的形态学变化。
2 结果与分析
2.1 精致黄芪多糖的提取率
本次试验共取450.24g黄芪，经过第一次水提醇沉法得到粗多糖57.81g，粗多糖得率为12.84%。然后通过三氯乙酸法去除蛋白后收得多糖43.71g，计算得到多糖收率为9.71%。醇沉以后的黄芪多糖经去蛋白，再通过DEAE柱层析即可得到精制黄芪多糖，质量为32.1g ，精制多糖得率为7.13%。
2.2 黄芪多糖过柱的洗脱曲线
图1 黄芪多糖的DEAE柱洗脱曲线
由图1可见，黄芪粗多糖经过洗脱分为两个峰，根据曲线合并4-12管的多糖。
2.3 倒置显微镜物对细胞形态的观察
在培养的整个过程中,每天在倒置显微镜下观察细胞形态并拍照。观察发现,骨髓细胞贴壁培养1d，除去未贴壁的细胞,更换含GM-CSF和IL-4的完全培养基后,可见细胞贴壁生长,呈均匀分布的细胞集落。细胞大小、形态均匀一致,有较好的折光度,无树枝样突起；第2天细胞疏松地贴附于板壁上呈簇状生长,形如葡萄串,但是细胞形态未见明显变化；第3天,细胞成簇生长,大多数细胞仍然贴壁,少数细胞处于半悬浮状态,细胞体积与原先接近,细胞核呈圆形或椭圆形较小,细胞周边可见细胞毛刺状突起,但毛刺较短；第4-5天,较多细胞呈半悬浮生长,可见大部分细胞呈梭型及不规则形状。细胞体积较以前增大,形态逐渐由圆形变为星形、梭形等不规则形状。培养到第6-7天,细胞体积较前增大,周边刺突十分明显,突起较粗大,分支较明显,细胞形态似星形或梭形,细胞核明显,细胞聚集生长,呈现典型的树突状细胞形态（图2）。
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