中国部分地区猪圆环病毒3型的分子流行病学研究
猪圆环病毒3型（porcine circovirus 3，PCV3）是2016年在美国首次鉴定出的新型圆环病毒。为探究PCV3在我国的分子流行病学特征，本研究对2016～2017年间从我国部分地区采集的198份临床病料样本进行PCV3检测，得到PCV3的阳性率为21.9%（34/198）。对阳性样本进行全基因组测序、基因比对分析，结果表明实验分离的7株PCV3之间的全基因组核苷酸序列同源性为98.8%～99.9%，与5条美国PCV3全基因组序列的同源性为98.8%～99.5%；7株PCV3之间的cap基因有98.0%～100.0%的同源性，与5条美国PCV3 cap基因的同源性为97.8%～99.4%。同时用PCV3全基因组及cap基因构建基因进化树，分析了我国PCV3流行毒株的亲缘关系。本研究从基因水平阐明了PCV3的流行现状。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1材料与方法 2
1.1病料采集 2
1.2 试剂与仪器 2
1.3 样本处理及病毒DNA提取 2
1.4 PCV3引物、阳性质粒的设计与合成 2
1.4.1 检测引物 2
1.4.2 全长扩增引物 2
1.4.3 阳性质粒 2
1．5 PCV3检测 2
1．6 PCV3基因组全长扩增及测序 3
1．6．1 1512bp的扩增及测序 3
1．6．2 765bp的扩增及测序 3
1．7 序列分析、进化树构建 3
2 结果与分析 3
2．1 PCV3 qPCR检测 3
2．2 目的基因扩增 4
2．3 PCV3基因同源性比对与系统进化分析 5
2．3．1 PCV3全基因组的同源性比对与系统进化分析 5
2．3．2 PCV3 cap基因的同源性比对与系统进化分析 6
3 讨论10
3．1 PCV3检测结果分析 10
3．2 PCV3基因进化分析 11
3 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
．3 研究意义 11
致谢 11
参考文献 12
2016～2017年间中国部分地区猪圆环病毒3型的分子流行病学研究
引言
1．6．2 765 bp的扩增及测序 反应体系50 μl：ddH2O 19 μl、上游引物（10 μM）2 μl、下游引物（10 μM）2 μl、2×LA Taq酶25 μl、模板2 μl。反应程序为：95℃ 5 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 60 s，35个循环；72℃ 7 min。
PCR产物电泳鉴定后清洁回收，进行TA克隆：将765 bp扩增产物与pMD18T于16℃连接1 h，然后转化到DH5α感受态细胞，用金属涂布棒在含氨苄青霉素的培养基上涂菌，37℃恒温箱中培养12 h，用20 μl灭菌枪头挑取单克隆菌落，直接放入含氨苄青霉素的培养液中，37℃摇床摇菌5 h，菌落PCR鉴定，反应程序同765 bp的扩增，菌液送南京擎科公司测序。
使用DNAMAN软件切除与765 bp连接的pMD18T载体的序列，得到765 bp的完整序列，同时以765 bp两端的序列覆盖1512 bp两端测序不准以及两者重合的部分，拼接两段序列，即得到PCV3全基因组序列。
1．7 序列分析、进化树构建
利用Lasergene软件的EditSeq功能将所有PCV3全基因组的起始序列统一为“TAGTATTAC”开头以利于比较。利用MEGA 7.0软件，将所有得到的PCV3基因组序列与国内外圆环病毒参考株比对，并采用邻接矩阵法构建进化树。
2 结果与分析
2．1 PCV3 qPCR检测
检测的198份临床样本中，PCV3阳性样本共39份，其中辽宁1份、山东1份、安徽4份、江苏10份、浙江7份、江西2份、湖北6份、湖南2份、广西6份，而河北、北京、福建均未检测到PCV3，故PCV3阳性率为21.9%（39/198）。采样地区及PCV3阳性地区分布情况见图1、图2。
从组织分布看，肺、脾、淋巴结、流产胎儿组织、粪便等组织中都可检测到PCV3。
图1 采样地区
Fig.1 sampling areas
图2 PCV3阳性地区
Fig.2 PCV3 positive areas
2．2 目的基因扩增
利用两对引物对从临床病料中提取的病毒核酸及合成的阳性质粒进行765 bp和1512 bp条带扩增，结果显示核酸样品与阳性模板的目的条带在同一水平位置，且条带单一，说明设计的两对引物和反应条件都适合PCV3基因的扩增。图3、图4显示不包括阳性对照的扩增产物鉴定结果。
图3 765bp鉴定结果 图4 1512bp鉴定结果
Fig.3 Restriction of 765bp Fig.4 Restriction of 1512bp
M：DL2000 DNA Marker；17：分离株扩增条带 M：DL2000 DNA Marker；1：阳性条带；2：阴性条带
M：DL2000 DNA Marker；17：Amplified bands of isolates M：DL2000 DNA Marker；1：Positive band；2：Negative band
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1材料与方法 2
1.1病料采集 2
1.2 试剂与仪器 2
1.3 样本处理及病毒DNA提取 2
1.4 PCV3引物、阳性质粒的设计与合成 2
1.4.1 检测引物 2
1.4.2 全长扩增引物 2
1.4.3 阳性质粒 2
1．5 PCV3检测 2
1．6 PCV3基因组全长扩增及测序 3
1．6．1 1512bp的扩增及测序 3
1．6．2 765bp的扩增及测序 3
1．7 序列分析、进化树构建 3
2 结果与分析 3
2．1 PCV3 qPCR检测 3
2．2 目的基因扩增 4
2．3 PCV3基因同源性比对与系统进化分析 5
2．3．1 PCV3全基因组的同源性比对与系统进化分析 5
2．3．2 PCV3 cap基因的同源性比对与系统进化分析 6
3 讨论10
3．1 PCV3检测结果分析 10
3．2 PCV3基因进化分析 11
3 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
．3 研究意义 11
致谢 11
参考文献 12
2016～2017年间中国部分地区猪圆环病毒3型的分子流行病学研究
引言
1．6．2 765 bp的扩增及测序 反应体系50 μl：ddH2O 19 μl、上游引物（10 μM）2 μl、下游引物（10 μM）2 μl、2×LA Taq酶25 μl、模板2 μl。反应程序为：95℃ 5 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 60 s，35个循环；72℃ 7 min。
PCR产物电泳鉴定后清洁回收，进行TA克隆：将765 bp扩增产物与pMD18T于16℃连接1 h，然后转化到DH5α感受态细胞，用金属涂布棒在含氨苄青霉素的培养基上涂菌，37℃恒温箱中培养12 h，用20 μl灭菌枪头挑取单克隆菌落，直接放入含氨苄青霉素的培养液中，37℃摇床摇菌5 h，菌落PCR鉴定，反应程序同765 bp的扩增，菌液送南京擎科公司测序。
使用DNAMAN软件切除与765 bp连接的pMD18T载体的序列，得到765 bp的完整序列，同时以765 bp两端的序列覆盖1512 bp两端测序不准以及两者重合的部分，拼接两段序列，即得到PCV3全基因组序列。
1．7 序列分析、进化树构建
利用Lasergene软件的EditSeq功能将所有PCV3全基因组的起始序列统一为“TAGTATTAC”开头以利于比较。利用MEGA 7.0软件，将所有得到的PCV3基因组序列与国内外圆环病毒参考株比对，并采用邻接矩阵法构建进化树。
2 结果与分析
2．1 PCV3 qPCR检测
检测的198份临床样本中，PCV3阳性样本共39份，其中辽宁1份、山东1份、安徽4份、江苏10份、浙江7份、江西2份、湖北6份、湖南2份、广西6份，而河北、北京、福建均未检测到PCV3，故PCV3阳性率为21.9%（39/198）。采样地区及PCV3阳性地区分布情况见图1、图2。
从组织分布看，肺、脾、淋巴结、流产胎儿组织、粪便等组织中都可检测到PCV3。
图1 采样地区
Fig.1 sampling areas
图2 PCV3阳性地区
Fig.2 PCV3 positive areas
2．2 目的基因扩增
利用两对引物对从临床病料中提取的病毒核酸及合成的阳性质粒进行765 bp和1512 bp条带扩增，结果显示核酸样品与阳性模板的目的条带在同一水平位置，且条带单一，说明设计的两对引物和反应条件都适合PCV3基因的扩增。图3、图4显示不包括阳性对照的扩增产物鉴定结果。
图3 765bp鉴定结果 图4 1512bp鉴定结果
Fig.3 Restriction of 765bp Fig.4 Restriction of 1512bp
M：DL2000 DNA Marker；17：分离株扩增条带 M：DL2000 DNA Marker；1：阳性条带；2：阴性条带
M：DL2000 DNA Marker；17：Amplified bands of isolates M：DL2000 DNA Marker；1：Positive band；2：Negative band
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