萱草根中蒽醌类化合物的提取分离研究(附件)
摘 要本论文是研究萱草根中蒽醌类成分的提取分离条件，采用有机溶剂乙醇提取萱草根中的蒽醌类物质，碱梯度提取法提取分离出不同酸性的蒽醌成分，紫外可见分光光度法测其含量。通过单因素试验确定提取萱草根中蒽醌类化合物的较佳的工艺条件为：乙醇浓度为60%，料液比为1:10，浸提温度为30 ℃，每次6小时，提取率达到94%左右。关 键 词：萱草根；蒽醌类成分；提取；分离Abstract This thesis is the extraction of anthraquinones in the study of Hemerocallis root separation conditions, Hemerocallis roots of anthraquinone compounds are extracted with organic solvents of ethanol and gradient alkaline extraction method to extract and isolate the anthraquinones with different acidity were, UV visible spectrophotometric determination of its content. Through the single factor test to determine the extraction of anthraquinones in Hemerocallis roots better process conditions: ethanol concentration was 60%, material to liquid ratio of 1:10, extraction temperature of 30 ℃, every 6 hours, extraction rate reached 94%.Key words: Hemerocallis roots; Anthraquinones ; Extraction; Separation1 前言1.1 课题的来源及意义 11.2 国内外发展情况 11.2.1 研究现状 11.2.2 发展趋势 21.3 萱草根中所含的化学成分 21.3.1 蒽醌类化合物 21.3.2 内酰胺衍生物 21.3.
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traction rate reached 94%.Key words: Hemerocallis roots; Anthraquinones ; Extraction; Separation1 前言1.1 课题的来源及意义 11.2 国内外发展情况 11.2.1 研究现状 11.2.2 发展趋势 21.3 萱草根中所含的化学成分 21.3.1 蒽醌类化合物 21.3.2 内酰胺衍生物 21.3.3 苷类化合物 31.3.4 生物碱 31.3.5 萜类 31.4 萱草根的药理作用 31.4.1 抗肿瘤作用 31.4.2 抗菌作用 31.4.3 抗血吸虫的作用 41.5 蒽醌类化合物的提取方法 41.5.1 水提取法 41.5.2 超声波提取法 41.5.3 微波萃取技术 51.5.4 超临界CO2萃取技术(SFE-CO2) 51.5.5乙醇提取法 61.6蒽醌的分离纯化方法研究 61.6.1 大孔吸附树脂法 61.6.2 pＨ值梯度萃取法 71.6.3 其他方法 71.7 本实验采取方案 72 实验材料与方法2.1 实验材料和试剂 92.2 实验仪器 92.3 实验方法 102.3.1萱草根的处理 102.3.2提取工艺 102.3.3碱梯度提取法分离 112.3.4蒽醌类化合物的鉴定 112.3.5 萱草根中蒽醌类化合物的含量测定 113结果与分析3.1 1,8-二羟基蒽醌最大吸收峰的确定 133.2标准曲线的绘制 133.3稳定性试验结果 143.4重现性实验结果 143.5加样回收率实验结果 153.6蒽醌类化合物乙醇浸提条件的选择 153.6.1 提取温度对提取效果的影响 153.6.2 提取液乙醇浓度对提取效果的影响 163.6.3料液比对提取率的影响 173.6.4提取时间对提取率的影响 18结 论 17参考文献 21致 谢 231 前言1.1 课题的来源及意义萱草(Hemerocallis fulva)，是一种常见的中药，它的科属百合科，为多年生长的草本植物。萱草，别名也叫黎芦，它的入药部位主要为根和花。而它的根的特点是性凉味甘,有小毒，所以主要治疗炎症、红肿、热痛、乳汁不下、小便不利等症状。萱草根和萱草花这两种药用部位的重要的化学成分为蒽醌和2,5-二氢呋喃酰胺衍生物，还含有生物碱、黄酮、萘酚、甾醇、皂甙、脂肪族、单苯环衍生物等化学成分[1]。具有腹泻，抗菌，利尿，止血，抗癌等这些药理作用是蒽醌类化合物所具有的。此外，它在结核和肿瘤这方面也发挥着显著的作用，比如萱草根用于治疗血吸虫病，癌症等。而且其中含有的这些化学成分具有极佳的营养价值及药用价值，因此，这些对人体而言极其有益[2]。所以，当人们生活水平逐渐提高时，也越来越重视从天然物质中寻找这些具有医疗保健作用的药物或功能因子，比如萱草根中含有秋水仙碱，它对有丝分裂具有明显的抑制作用，因而在临床上被用于治疗乳腺癌，皮肤癌，白血病等。萱草根中还含有萱草毒素，具有较强的抗结核菌活力，另外它的抗血吸虫活性也比较显著。可见对于萱草根化学成分及药理作用的研究具有一定的意义。1.2 国内外发展情况1.2.1 研究现状 蒽醌类化合物提取分离方法的研究现况：当前，对于蒽醌类化合物的提取分离的方法有紫外可见分光光度法，高效液相色谱法，索氏提取法，层析分离法，超声提取法，微波提取法，有机溶剂萃取法等[3]。但最常用的是索氏提取法和有机溶剂提取法，由于这种方法的提取率比用其他方法高，生产周期短，浓缩回收方便，不像其他种方法复杂，流程简单，生产成本低。 蒽醌类物质研究现状：对于萱草根中有效成分的药理作用的研究是当前中药研究的热点，由于蒽醌类化合物中含有特征性的羰基和邻位的酚羟基，因此，蒽醌类化合物能和大部分的金属类物质形成配合物。正像如今的一些研究报道：在体外抗肿瘤方面起主要作用的是一定量的蒽醌类金属配位化合物。1.2.2 发展趋势 提取蒽醌类化合物的发展趋势：提取蒽醌类化合物的方法非常多，比如，紫外可见分光光度法，高效液相色谱法，索氏提取法，层析分离法，超声提取法，微波提取法，有机溶剂提取，甲醇超声提取等提取蒽醌类化合物，这些方法的优点是简单、快速，但很难提取单蒽醌活性成分。如果想得到单一蒽醌活性成分，需通过多次重结晶或色谱分离，才能获得。原因是它常常与酸相似的蒽醌、鞣质，蛋白质，碳水化合物，糖和树胶等，使提取液变得黏稠。所以，以上这些做法比较复杂并且收率还低。而乙醇提取法是平时最常见的，它将广泛的应用于提取这类化合物。因为乙醇具有对细胞的穿透力强，醇提取液粘度小，易过滤，沸点低，浓缩回收方便，不容易发霉变质， 提取率比用其他方法高，生产周期还短，流程简单，生产成本低等优点。 蒽醌类物质发展趋势：蒽醌类物质在植物界中不但分布非常的广泛，而且还具有很显著的药理活性，因此在市场上具有很广阔的应用前景，但是目前只有几种中药的化学成分才有详细的研究，现如有一些较好的民间药物还未被开发和利用。就因为如此，我们可以考虑蒽醌类与具有特定生物学活性的金属离子组装成配合物，再加上蒽醌中含有羰基氧和羟基，以及结合现代医学的具体要求和蒽醌类金属配合物的成功开发先例[4-7]，加强此类化合物的开发利用。再者就是目前对该属植物的化学和药理研究还不够深入、系统。为充分利用其丰富的植物资源以及扩大其药用价值,继而使其植物发挥最大的药用、保健价值,所以对其研究要更深入、系统。1.3 萱草根中所含的化学成分1.3.1 蒽醌类化合物萱草，这类草本植物中因蒽醌含量很高，所以此类化合物的研究较多[8]。一些人 在萱草的根中分离出了一些蒽醌类物质，这些蒽醌类物质主要为大黄素型蒽醌, 即取代基分布在两侧的苯环上，它们分别是:甲基大黄酸、大黄酸、大黄酚、1,8 -二羟基-3-甲氧基蒽醌、美决明子素甲醚、美决明子素、芦荟大黄、黄花蒽醌。1.3.2 内酰胺衍生物从文献中查知萱草中分得具有2,5-二氢呋喃的氮基酸衍生物结构的oxypinnatanine，随后，又从日本萱草中分得相类似化合物longitubanineA,B及Pinnatanine。在 1990-1996年,连续报道出[9]从萱草中分得与上述化合物相类似的2,5-二氢呋喃基-γ-内酰胺衍生物。1.3.3 苷类化合物 杨中铎[10]通过柱色谱方法进行分离纯化研究了萱草根中的化学成分，根据化/合物的理化性质和光谱数据进行结构鉴定。继而得出此结果：萱草根正丁醇提取物中分离得到的几个苷类化合物分别为璋牙菜苷，laganin,picraquassioside C葛根素，3-甲氧基葛根素，3,5-二羟基甲苯，3-O-β-D-葡萄糖苷，长春藤皂苷元3-O-β-D-葡萄糖吡喃-(1-3)-a-阿拉伯糖吡喃基苷28-O-β-D-葡萄糖吡喃基酯等。其中最重要的是用血糖溶血实验测得萱草根中还有含皂苷[11]。1.3.4 生物碱 秋水仙碱是茉莉生物碱，也是一种酚酮类生物碱，萱草的根、叶和花中均有较高的含量[12]。它的药理作用主要是抑制细胞有丝分裂，在这方面具有显著的效果，已在临床上用于乳腺癌、皮肤癌、白血病的治疗。1.3.5 萜类 一些研究者[13]从萱草根中分离得到21个化合物，其中7个为三萜类化合物,分别为3α-乙酰基-11-氧代-12-乌苏烯-24-羧酸、3-氧代羊毛甾-8,24-二烯-21-羧酸、3β-羟基羊毛甾-8,24-二烯-21-羧酸、3α-羟基羊毛甾-8,24-二烯-21-羧酸、α-乳香酸、β-乳香酸、11α-羟基-3-已酰基-β-乳香酸。1.4 萱草根的药理作用1.4.1 抗肿瘤作用 之所以萱草根对细胞有丝分裂具有明显的抑制作用，还在临床上已用于乳腺癌、皮肤癌、白血病的治疗，是因为萱草根中含有秋水仙碱，此外，萱草中含有的大黄素对肺癌A-549细胞DNA的生物合成具有明显的抑制作用[14]。1.4.2 抗菌作用 章谷生等[15]用化学方法分离萱草各组份，他从结果中首次发现，有较强的抗结核菌活力的是用乙醚提出的浸膏。继而从乙醚浸膏中提出5种组份，并进一步分出萱草毒素、萱草甲素、乙素、丙素和戊素等5种成分。上述各组份和成分在液体培养基中均有一定的抗结核菌能力，但是最为显著的是萱Ⅲ和萱Ⅳ，因其有效成分具耐热性，所以经加热破坏其毒性后，它还仍具抗菌能力。1.4.3 抗血吸虫的作用 蒽醌类化合物以及2-羟基大黄酚具有显著的抗血吸虫作用。分别能在15、14分钟这两个阶段中可以使所有的血吸虫幼虫完全凝固。所以，这类物质对有效药物的开发和血吸虫病的治疗会有很好的发展前景。1.5 蒽醌类化合物的提取方法1.5.1 水提取法 水提取法者们分析指出药物的热过程是与降解、水解蒽醌类成分有关，因为蒽醌类化合物之间相互转化。且蒽醌类成分容易受湿热影响，在有机相中较水中稳定，氧气可能参与其降解过程。而传统的水煎煮法，粉碎度对活性成分的提取率影响很大。水提取法者等的研究结果表明，药材总蒽醌提取物含量（3.11%）明显高于普通粉6号筛水提取物（1.09%）[16]。虽然超微粉碎能使植物的细胞壁破损、均匀草药的粒度、增大表面面积，也有利于化学成分溶出，但是在溶出化学成分时也有大量杂质。所以，一些研究者还尝试加入表面活性剂来提高对药材中总蒽醌的提取率。还一些研究人员研究了聚山梨酯85，聚山梨酯80，十二烷基硫酸钠（SDS），十二烷基磺酸钠等，且对比了对药材总蒽醌提取率范围的影响。他们发现了SDS对药材游离与结合蒽醌均有增溶作用，可大幅度提高药材中总蒽醌的提取率[17]。1.5.2 超声波提取法 超声波[18]是一种弹性机械振动波，可产生剧烈的振动，能破损植物细胞壁，加快化学因子的溶出，缩短提取时间，也避免了高温热敏感材料的影响，还具有产量高，设备简单，操作方便，节省时间和能源的特点。而且，近年来在中药有效成分提取中是经常使用的，所以有非常广阔的应用前景。有人用95%的乙醇作为溶剂，探究提取时间对该药材的粒度和蒽醌提取率的的影响，结果发现，超声提取药材粒度越小，总蒽醌提取率高 [19]。还有一些人用水作为溶剂，研究了对药材蒽醌提取率的影响因素，最后发现,如果提取时间相同，超声强度的增加，总蒽醌、游离蒽醌的提取率随其略有下降；超声强度相同时，如果超声时间增加，总蒽醌、游离蒽醌的提取率随其增大，但达到最高值时，再延长超声时间，提取率反而降低；因此优选出了以水为溶剂超声提取药材总蒽醌的条件，还通过正交法证明了超声提取时乙醇的提取率高于其他的方法。大量的研究表明：与水提取法相比，超声波辅助提取技术，优势明显，不仅实现对药提取制备生产工业化过程。而且在提取率、产品安全性等方面也是非常理想的一种方法。但是由于超声波是一种弹性机械振动波，可产生猛烈的振动，有可能会破坏药材的有效成分。所以它并不是理想的方法。1.5.3 微波萃取技术 微波是指频率在300～300K MHz的高频电磁波，它的穿透能力很强。微波萃取技术是基于微波加热和材料中目标组份的选择性萃取的一种新工艺。但它不同于普通的加热，而是对细胞直接作用，它是一种内部加热方式，所以它能增强和加速溶剂中溶质，从而提高溶解速度，达到更高的产量，但对微波萃取效率有很大影响的是溶剂的极性，这一点是值得注意的。最后，在许多的实验结果中发现，与总蒽醌的提取率和提取时间的比较，微波提取优于沸水和超声波法，它具有选择性好、提取效率高、溶剂耗量少、省时、节能、环保、设备简单、适应面广等优点，但由于在微波提取过程中总是以辐射状态直接加热植物细胞材料，它的有效成分可能导致变构，热敏性物质的分解，失效。所以，微波提取法对药材有效成分的药理功用和疗效有无影响，还需作进一步探究。1.5.4 超临界CO2萃取技术(SFE-CO2) 由于超临界CO2萃取技术具有双重液体和气体的特性，对许多物质具有很强的溶解能力，基本上不含有机溶剂。因此，超临界流体萃取法近年来备受青睐，因为它可能成为一种有望实现工业化生产的绿色中药提取新技术。其主要优点包括:适于热敏性物质提取，几乎无有机溶剂残留，提取效率高，产品质量稳定，流程简单，操作方便，节约能耗等。大部分常用的超临界流体二氧化碳，它可以接近常温。虽然具有很多优点但是也有一定的的选择性，较小的化合物容易提取。而对极性较大的SFE-CO2化合物萃取较难。此中草药中虽然含有游离蒽醌，但主要是以蒽醌甙为主，因此，超临界CO2萃取工艺参数也一直是人们关心的问题。一些研究者采用上述SFE-CO2萃取条件与传统溶剂法、超声提取法进行了比较，结果显示，SFE-CO2萃取法提取药材游离蒽醌的提取率高于其他方法，但由于药物主要是结合蒽醌，所以总蒽醌提取率最高的是超声法(2.448%)大于SFE法(1.884 %)和溶剂法(1.833 %)[20]。就目前的研究进展来分析，超临界流体萃取法萃取的蒽醌总数率并不高，是因为超临界CO2流体性质的有限所影响的，所以，许多研究者利用SFE-CO2萃取萱草根中蒽醌类物质，还的进一步研究温度和夹带剂种类及工艺参数对其影响。1.5.5 乙醇提取法 ? 乙醇提取法是指利用乙醇的溶解性，将乙醇作为溶剂对物质进行分离提纯的方法，此方法在提取中药的有效成分中广泛应用。因中药所含的化学成份十分复杂，既含有多种有效成份，又含有无效成份，也包含有毒成份。提取其有效成分需进一步加以分离、纯化，才能得到有效单体。而乙醇正好具备对细胞的穿透力强，醇提取液粘度小，易过滤，沸点低，浓缩回收方便简单，不容易发霉变质， 提取率比用其他方法高，生产周期短，流程简单，生产成本低等优点[21]。1.6 蒽醌的分离纯化方法研究 为了提高提取物的纯度，同时因现代制剂降低浸膏率的需要，研究者们在纯化萱草根中蒽醌类化合物的总提取物方面也作了大量研究，多采用大孔树脂、聚酰胺、明胶沉淀、醇调pH值、碱梯度提取法等方法，其中，研究较多、效果较好的是碱梯度提取法。如一些研究者对比研究了明胶沉淀、碱梯度提取法、聚酰胺以及大孔吸附树脂对萱草根中总蒽醌的富集作用，他们研究的结果是：碱梯度提取法对萱草根中总蒽醌富集效果最好[22]。其他的研究人员利用70%乙醇洗脱大孔吸附树脂，得到的结果是萱草根中的总蒽醌产量为80% [23]。1.6.1 大孔吸附树脂法 大孔吸附树脂具有多孔结构和很高的比表面积，可选择性地吸附有机物，具有选择性好、机械强度高、再生处理方便、吸附速度快等优点，在中药的提取、纯化方面应用价值较高。但不同型号的大孔吸附树脂具有不同的极性、孔径、比表面积、孔容等,因此其分离、富集效果也不同。同时，净化过程的影响也受了洗脱剂种类，浓度，体积，程序，流量等因素的影响，所以，提取分离萱草根中的蒽醌化合物时，对于不同类型的大孔吸附树脂的应用也不同。一些研究人员进行比较筛选，以获得高纯度的产品。1.6.2 pＨ值梯度萃取法 蒽醌类化合物不但有酚羟基且酸性强弱也各有差异，利用这个特点，继而对游离蒽醌采用pH值梯度萃取法进行分离纯化。如陈琼华等用20%硫酸溶液和氯仿的混合液水浴回流水解提取药材，氯仿提取液再相继以5%碳酸氢钠、5%氢氧化钠等溶液萃取后，分别酸化、分离得到大黄酸、大黄素等游离蒽醌[24]。王慧春等采用20%硫酸和氯仿的混合液，水浴回流水解、提取萱草根中的游离蒽醌，氯仿提取液再采用5%碳酸氢钠、5%碳酸钠、0.25%氢氧化钠和5%氢氧化钠分别萃取并进行分离纯化[25]。1.6.3 其他方法 此外，还可采用吸附柱色谱对萱草根中的蒽醌类化合物进行分离，常用的吸附剂有硅胶、聚酰胺、磷酸氢钙等。其中以硅胶为多，为了抑制蒽醌的解离，通常可在硅胶中加入少量草酸或柠檬酸。蒽醌苷还可采用葡聚糖凝胶色谱进行分离纯化。1.7 本实验的研究方案 经过对国内外近20年来的文献查阅、整理、分析与总结，从而得出相关萱草根药理功效以及萱草的主要成分为蒽醌和 2,5 -二氢呋喃酸胺衍生物。因其有上述的化学成分和药理功效[26]，所以萱草含有多种于人体有利的化学因素，具备极佳的营养价值及药用价值，以及其更重要的是应用于对血吸虫病的医治，也能抗结核、抗菌、抗肿瘤等；而萱草花的重要的药理作用是镇定安神，也具备抗抑郁、防止肝炎等功效。综上所述，从萱草根中提取并分离蒽醌类成分的方法是采用有机溶剂乙醇提取法提取萱草根中的蒽醌类物质和碱梯度萃取法提取分离不同酸性的蒽醌成分，因为采用这样的方法比其他的提取法明显提高了蒽醌类成分的提取率，缩短了提取时间。所以乙醇的提取率明显高于水、超声提取法、微波提取法、超零界二氧化碳提取法，因此目前多采用乙醇回流、渗滤等方式进行提取中药。从而本课题以萱草根为原料，以蒽醌类化合物的提取量为指标，采用有机溶剂乙醇提取法提取萱草根中的蒽醌类物质，再用碱梯度提取法分离萱草根中的蒽醌类化合物，并进行光谱分析鉴定，通过本课题的研究，旨在熟练掌握有机溶剂连续提取法、碱梯度提取法、重结晶等实验技术。 2 实验材料与方法2.1 实验材料和试剂 表2.1实验药品和试剂试剂名称规格生产厂家甲醇分析纯湖南师大化学试剂厂乙醇分析纯长沙安泰精细化工有限公司氯仿分析纯临沂市万泉化工厂醋酸镁分析纯国药集团化学试剂有限公司三氯化铁分析纯国药集团化学试剂有限公司硫酸分析纯株洲开发区石英化玻有限责任公司1，8-二羟基蒽醌对照品纯度>99%中国药品生物制品检定所萱草根药材药用咸阳市中药店乙醚分析纯天津市风船化学试剂技术有限公司盐酸分析纯西安旭煌生物技术有限公司碳酸氢钠分析纯天津福晨化学试剂厂氢氧化钠分析纯广东光华化学试剂厂丙酮分析纯广东台山粤侨化学试剂厂注释：萱草根药材经雷国莲教授鉴定确认2.2 实验仪器表2.2 实验主要仪器仪器名称仪器型号生产厂家多功能食物搅拌器JH300型广东顺德长兴塑料五金厂光学读数分析天平TG328A型湘仪天平仪器厂恒温水浴锅W20lB型上海申胜生物技术有限公司低温冷却液循环泵DLSB-5/20型郑州长城科工贸有限公司旋转蒸发器R-201型上海申生科技有限公司真空干燥箱DZF-6050型郑州长城科工贸有限公司电热恒温鼓风干燥箱DHG-9073型上海山连实验设备有限公司紫外可见分光光度计756-MC型上海精密科学仪器有限公司2.3 实验方法2.3.1 萱草根的处理 称取一定量的萱草根药材在80 ℃烘干，粉碎后过20目筛，备用。2.3.2 提取工艺 称取萱草根的原料药材(500 g)，加入4倍量乙醇，加热到乙醇沸点(保持微沸一定时间)，过滤收集乙醇提取液，余渣如上法提取2次(每次乙醇用量为2倍量)，合并滤馏回收乙醇，成浸膏，溶解浸膏(加入一定量沸水)，萃取(加入一定量醋酸乙液，浓缩至一定量，沉淀(加入2倍量乙醇)，静置过夜，过滤(除去杂质)，减压蒸酯)，收集醋酸乙酯溶液中不溶物质，如上法使用醋酸乙酯将不溶物质萃取3次，合并不溶物质，溶解(用一定量30%乙醇溶解收集的不溶物质)，等分3等份上述溶液备用。 2.3.3 碱梯度提取法分离 (1)大黄酸的分离：将含有游离蒽醌的乙醚溶液转移至分液漏斗，提取（用5%的碳酸氢钠水溶液一定量），分层放置，释放下层碳酸氢钠水溶液，放置入另一个三角烧瓶，同法操作两次，合并提取液，搅拌下滴入5 mol/L盐酸溶液，调pH值为2.0，稍放置沉淀，过滤，洗至中性，干燥，得大黄酸。 (2)大黄素的分离：留存在分液漏斗中的乙醚溶液，每次用5%碳酸钠水溶液一定量提取2～3次，直至提取液呈色较浅，合并碳酸钠提取液，滴入5 mol/L盐酸溶液，调pH值2.0，放置，沉淀完全，过滤，水洗至中性，干燥，得大黄素。 (3)大黄酚和大黄素甲醚混合物的分离：留存在分液漏斗中的乙醚溶液，以每次一定量2%氢氧化钠（pH=13）的水溶液提取2～3次，再用蒸馏水提取2次洗去碱液，合并氢氧化钠和水的提取液，滴入5 mol/L盐酸溶液，调pH值2.0，放置，使之沉淀完全，过滤，洗至中性，干燥，得大黄酚和大黄素甲醚混合物。2.3.4 蒽醌类化合物的鉴定 将产品进行UV分析,结果为232、253、287、355、423 nm,符合文献[27]给出的蒽醌类化合物的UV吸收谱带范围。同时将产品Borntrager进行显色反应,结果呈现紫红色，再将产品和醋酸镁反应呈现红色。从以上结果可以认为得到的产品是蒽醌类化合物。2.3.5 萱草根中蒽醌类化合物的含量测定 1、对照品标准溶液的制备精密称取1,8-二羟基蒽醌标准品10 mg,用甲醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，即为1,8-二羟基蒽醌对照品标准溶液(浓度为0.l mg/mL)。避光冷藏备用。2、1,8-二羟基蒽醌的紫外可见光谱移取1,8-二羟基蒽醌对照品标准溶液[28]于圆底烧瓶中，减压蒸馏回收甲醇，加0.5%醋酸镁-甲醇溶液使之显色，摇匀使之溶解，定容于10 mL容量瓶中。取其溶液于450-700 nm范围内扫描其紫外可见吸收光谱，确定其最大吸收波长。3、标准曲线的绘制方法精密移取1,8-二羟基蒽醌对照品标准溶液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL减压蒸馏回收甲醇，加0.5%醋酸镁-甲醇溶液使之显色，摇匀使之溶解，定容于10 mL容量瓶中，以0.5%醋酸镁-甲醇溶液作空白液，在最大吸收波长处测量其吸光度，以吸光度(A)对浓度(C)作标准曲线并拟合出线性回归方程。4、稳定性实验 精密移取1,8-二羟基蒽醌对照品标准溶液(浓度为0.1 mg/mL)1.0 mL，减压蒸馏回收甲醇，加0.5%醋酸镁-甲醇溶液使之显色，摇匀使之溶解，定容于10 mL容量瓶中，在2.5小时内每间隔0.5小时测定一次吸光度并计算其相对标准偏差RSD(RSD=标准偏差/平均值)。5、加样回收率实验 精密移取5份样品制备液各1.0 mL，加入1,8-二羟基蒽醌对照品标准溶液(浓度为0.1 mg/mL)2.0 mL，减压蒸馏回收甲醇，加0.5%醋酸镁-甲醇溶液使之显色，摇匀使之溶解，定容于25 mL容量瓶中，测定其吸光度，并计算出加样回收率及相对标准偏差RSD(RSD=标准偏差/平均值)。3 结果与分析3.1 1,8-二羟基蒽醌最大吸收峰的确定 图3.1 1,8-二羟基蒽醌甲醇溶液的紫外可见吸收光谱图3.2 1,8-二羟基蒽醌醋酸镁溶液的紫外可见吸收光谱 由图3.1及图3.2可见1,8-二羟基蒽醌的甲醇溶液最大吸收波长为561 nm处。加入0.5%醋酸镁-甲醇溶液显色后，其最大吸收波长移至506 nm处。因此,在后续的检测中选定506 nm为检测波长。3.2 标准曲线的绘制 图3.3 1,8-二羟基蒽醌标准曲线 图3.3为1,8-二羟基蒽醌对照品标准溶液加入0.5%醋酸镁-甲醇溶液显色后的标准曲线图。从图中可以看出，吸光度与浓度存在正比的关系，拟合得线性回归方程:A=27.70C+0.0057，相关系数R2=0.9995，表明吸光度A与蒽醌类化合物浓度C在0.005-0.025 mg/mL范围内呈现良好的线性关系。3.3稳定性试验结果 表3.3为稳定性实验结果，从表中可以看出在2小时测定5次吸光度平均值0.283符合线性回归方程，每次测定吸光度的数值变化不大且稳定性结果的RSD为0.4%,表明紫外-可见分光光度法测定蒽醌类化合物具有很高的稳定性。表3.3 稳定性考察时间/小时00.51.01.52.0平均值RSD%吸光度0.2830.2820.2840.2840.2820.2830.43.4重现性实验结果 表3.4为重现性试验结果，从表中可以看出平均吸光度为0.283符合线性回归方程，平行5次测试的吸光度数值变化不大且重现性实验结果的RSD仅为0.3%,表明紫外-可见分光光度法测定蒽醌类化合物具有很好的重现性。表3.4 重现性实验实验号12345平均值RSD%吸光度0.2830.2840.2830.2840.2830.2830.33.5加样回收率实验结果表3.5为加样回收率实验结果，从表中可以看出5次实验的回收率变化不大且平均加样回收率为99.8%,RSD为0.8%。表明紫外-可见分光光度法测定蒽醌类化合物具有很好的准确性。表3.5 加样回收率试验编号样品中含量(mg)加对照品量(mg)实际测定值(mg)回收率(%)RSD(%)10.1560.2000.359100.620.1540.2000.35199.230.1530.2000.35199.40.840.1580.2000.36299.250.1590.2000.362100.83.6蒽醌类化合物乙醇浸提条件的选择 在乙醇浸提法提取萱草根蒽醌类化合物的过程中,提取时间、乙醇浓度、料液比、提取温度等因素都会对提取率有比较大的影响。通过单因素实验，确定了对萱草根蒽醌类化合物最佳提取条件。3.6.1 提取温度对提取效果的影响 表3.6 提取温度对蒽醌化合物提取率的影响提取温度(℃)1020304050吸光度(A)0.3450.4320.7860.6350.612图3.4 提取温度对蒽醌化合物提取率的影响 由图3.4可知，由于适当的加温，可以促使细胞内的活性成分运动加剧从而有利于蒽醌类化合物的溶出，也促使提取效率的增加。当温度低于30 ℃时，萱草根中总蒽醌类化合物和游离态蒽醌类化合物的提取率都随温度升高而增加,当温度达到30 ℃时，提取率达到最大。由于温度过高时，会引起乙醇的挥发及游离态蒽醌类化合物的氧化而降低总蒽醌类化合物的提取率。因此,随着温度的继续升高，则提取率呈现下降趋势。所以确定30 ℃为最佳提取温度。3.6.2 提取液乙醇浓度对提取效果的影响 表3.7 乙醇浓度对蒽醌化合物提取率的影响乙醇浓度(%)4050607080吸光度(A)0.3120.3340.8320.7450.613图3.5 乙醇浓度对蒽醌化合物提取率的影响 由图3.5可知，当乙醇浓度小于60%时，随着乙醇浓度的增大，萱草根中的蒽醌类化合物的提取率增大。当乙醇浓度大于60%时，萱草根中的蒽醌类化合物的提取率反而呈下降趋势。由于低浓度乙醇溶液可以促进蒽醌苷的溶出，而高浓度的乙醇溶液则会使蒽醌苷沉淀出来，不利于总蒽醌类化合物的溶出。此外，游离态蒽醌类化合物的提取效率随着乙醇浓度的增大而增大(游离态蒽醌溶于乙醇不溶于水)。综合考虑选择60%乙醇作为提取剂的浓度。3.6.3料液比对提取率的影响表3.8 配料比对蒽醌类化合物的影响料液比1:81:91:101:111:12吸光度(A)0.4120.5130.7980.6320.431图3.6 配料比对蒽醌类化合物的影响由图3.6可知，萱草根中总蒽醌类化合物及游离态蒽醌类化合物的提取率随着料液比的增大而增加，而且增加效果很明显。但是，当料液比为1:8后提取率增加的趋势放缓。推断原因是随着料液比的增加，可以使细胞内外蒽醌类化合物的浓度变低，有利于活性成分的溶出。但从经济角度出发，料液比的增高会增加浓缩工作量。综合考虑选择料液比为1:10。3.6.4提取时间对提取率的影响表3.9 提取时间对蒽醌化合物提取率的影响提取时间(小时)45678吸光度(A)0.3210.3560.7890.6430.521图3.7 提取时间对蒽醌化合物提取率的影响 由图3.7可知，萱草蒽醌类化合物的提取效率随着时间的延长而增大。但是，当提取时间超过6小时后，萱草蒽醌类化合物的提取效率增大的趋势放缓逐步达到最大。这是由于细胞内外蒽醌类化合物浓度差的减小，造成活性成分的扩散作用减弱，从而导致提取效率的减小。因此,最佳的提取时间为6小时。结 论萱草根中蒽醌类的提取方法主要有有机溶剂萃取法、超临界流体萃取法、超声波萃取法和微波辅助萃取法等。而有机溶剂萃取法是国内外利用最广泛的方法之一，甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正己烷以及它们的水溶液或混合溶液是此法经常使用的溶剂。有研究显示，以甲醇和乙醇为提取溶剂时，提取效果最好。 该方法具有提取率高，杂质少，无毒，易于实现工业化生产等，可与溶剂分离，吸附树脂，离心浓缩，絮凝沉淀和膜技术结合使用。用碱梯度提取法从萱草根中提取分离出蒽醌类化合物，采用紫外可见分光光度法，以0.5%醋酸镁-甲醇溶液为显色剂，直接测定提取液中蒽醌类化合物的含量。通过在450-700 nm范围内进行紫外可见扫描，确定了506 nm为最大吸收波长，该方法操作简单，适合在提取生产中方便快捷、准确检测出蒽醌类化合物的含量，继而达到分离纯化的目的，为后续综合开发利用奠定可靠的基础。 经过试验确定从萱草根中提取蒽醌类化合物的较佳的工艺条件为：乙醇浓度为60%，料液比为1:10，浸提温度为30 ℃，每次6小时，提取率达94%。参考文献[1] 杨中铎, 李援朝. 萱草根化学成分的分离与结构鉴定[J]. 中国药物化学杂志，2003, 13(1): 34-35.[2] 王云峰, 赵丽晶, 徐博等. 萱草花的营养成分和生物活性研究进展[J]. 吉林医药学学报, 2012, 33(1): 47-49. 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traction rate reached 94%.Key words: Hemerocallis roots; Anthraquinones ; Extraction; Separation1 前言1.1 课题的来源及意义 11.2 国内外发展情况 11.2.1 研究现状 11.2.2 发展趋势 21.3 萱草根中所含的化学成分 21.3.1 蒽醌类化合物 21.3.2 内酰胺衍生物 21.3.3 苷类化合物 31.3.4 生物碱 31.3.5 萜类 31.4 萱草根的药理作用 31.4.1 抗肿瘤作用 31.4.2 抗菌作用 31.4.3 抗血吸虫的作用 41.5 蒽醌类化合物的提取方法 41.5.1 水提取法 41.5.2 超声波提取法 41.5.3 微波萃取技术 51.5.4 超临界CO2萃取技术(SFE-CO2) 51.5.5乙醇提取法 61.6蒽醌的分离纯化方法研究 61.6.1 大孔吸附树脂法 61.6.2 pＨ值梯度萃取法 71.6.3 其他方法 71.7 本实验采取方案 72 实验材料与方法2.1 实验材料和试剂 92.2 实验仪器 92.3 实验方法 102.3.1萱草根的处理 102.3.2提取工艺 102.3.3碱梯度提取法分离 112.3.4蒽醌类化合物的鉴定 112.3.5 萱草根中蒽醌类化合物的含量测定 113结果与分析3.1 1,8-二羟基蒽醌最大吸收峰的确定 133.2标准曲线的绘制 133.3稳定性试验结果 143.4重现性实验结果 143.5加样回收率实验结果 153.6蒽醌类化合物乙醇浸提条件的选择 153.6.1 提取温度对提取效果的影响 153.6.2 提取液乙醇浓度对提取效果的影响 163.6.3料液比对提取率的影响 173.6.4提取时间对提取率的影响 18结 论 17参考文献 21致 谢 231 前言1.1 课题的来源及意义萱草(Hemerocallis fulva)，是一种常见的中药，它的科属百合科，为多年生长的草本植物。萱草，别名也叫黎芦，它的入药部位主要为根和花。而它的根的特点是性凉味甘,有小毒，所以主要治疗炎症、红肿、热痛、乳汁不下、小便不利等症状。萱草根和萱草花这两种药用部位的重要的化学成分为蒽醌和2,5-二氢呋喃酰胺衍生物，还含有生物碱、黄酮、萘酚、甾醇、皂甙、脂肪族、单苯环衍生物等化学成分[1]。具有腹泻，抗菌，利尿，止血，抗癌等这些药理作用是蒽醌类化合物所具有的。此外，它在结核和肿瘤这方面也发挥着显著的作用，比如萱草根用于治疗血吸虫病，癌症等。而且其中含有的这些化学成分具有极佳的营养价值及药用价值，因此，这些对人体而言极其有益[2]。所以，当人们生活水平逐渐提高时，也越来越重视从天然物质中寻找这些具有医疗保健作用的药物或功能因子，比如萱草根中含有秋水仙碱，它对有丝分裂具有明显的抑制作用，因而在临床上被用于治疗乳腺癌，皮肤癌，白血病等。萱草根中还含有萱草毒素，具有较强的抗结核菌活力，另外它的抗血吸虫活性也比较显著。可见对于萱草根化学成分及药理作用的研究具有一定的意义。1.2 国内外发展情况1.2.1 研究现状 蒽醌类化合物提取分离方法的研究现况：当前，对于蒽醌类化合物的提取分离的方法有紫外可见分光光度法，高效液相色谱法，索氏提取法，层析分离法，超声提取法，微波提取法，有机溶剂萃取法等[3]。但最常用的是索氏提取法和有机溶剂提取法，由于这种方法的提取率比用其他方法高，生产周期短，浓缩回收方便，不像其他种方法复杂，流程简单，生产成本低。 蒽醌类物质研究现状：对于萱草根中有效成分的药理作用的研究是当前中药研究的热点，由于蒽醌类化合物中含有特征性的羰基和邻位的酚羟基，因此，蒽醌类化合物能和大部分的金属类物质形成配合物。正像如今的一些研究报道：在体外抗肿瘤方面起主要作用的是一定量的蒽醌类金属配位化合物。1.2.2 发展趋势 提取蒽醌类化合物的发展趋势：提取蒽醌类化合物的方法非常多，比如，紫外可见分光光度法，高效液相色谱法，索氏提取法，层析分离法，超声提取法，微波提取法，有机溶剂提取，甲醇超声提取等提取蒽醌类化合物，这些方法的优点是简单、快速，但很难提取单蒽醌活性成分。如果想得到单一蒽醌活性成分，需通过多次重结晶或色谱分离，才能获得。原因是它常常与酸相似的蒽醌、鞣质，蛋白质，碳水化合物，糖和树胶等，使提取液变得黏稠。所以，以上这些做法比较复杂并且收率还低。而乙醇提取法是平时最常见的，它将广泛的应用于提取这类化合物。因为乙醇具有对细胞的穿透力强，醇提取液粘度小，易过滤，沸点低，浓缩回收方便，不容易发霉变质， 提取率比用其他方法高，生产周期还短，流程简单，生产成本低等优点。 蒽醌类物质发展趋势：蒽醌类物质在植物界中不但分布非常的广泛，而且还具有很显著的药理活性，因此在市场上具有很广阔的应用前景，但是目前只有几种中药的化学成分才有详细的研究，现如有一些较好的民间药物还未被开发和利用。就因为如此，我们可以考虑蒽醌类与具有特定生物学活性的金属离子组装成配合物，再加上蒽醌中含有羰基氧和羟基，以及结合现代医学的具体要求和蒽醌类金属配合物的成功开发先例[4-7]，加强此类化合物的开发利用。再者就是目前对该属植物的化学和药理研究还不够深入、系统。为充分利用其丰富的植物资源以及扩大其药用价值,继而使其植物发挥最大的药用、保健价值,所以对其研究要更深入、系统。1.3 萱草根中所含的化学成分1.3.1 蒽醌类化合物萱草，这类草本植物中因蒽醌含量很高，所以此类化合物的研究较多[8]。一些人 在萱草的根中分离出了一些蒽醌类物质，这些蒽醌类物质主要为大黄素型蒽醌, 即取代基分布在两侧的苯环上，它们分别是:甲基大黄酸、大黄酸、大黄酚、1,8 -二羟基-3-甲氧基蒽醌、美决明子素甲醚、美决明子素、芦荟大黄、黄花蒽醌。1.3.2 内酰胺衍生物从文献中查知萱草中分得具有2,5-二氢呋喃的氮基酸衍生物结构的oxypinnatanine，随后，又从日本萱草中分得相类似化合物longitubanineA,B及Pinnatanine。在 1990-1996年,连续报道出[9]从萱草中分得与上述化合物相类似的2,5-二氢呋喃基-γ-内酰胺衍生物。1.3.3 苷类化合物 杨中铎[10]通过柱色谱方法进行分离纯化研究了萱草根中的化学成分，根据化/合物的理化性质和光谱数据进行结构鉴定。继而得出此结果：萱草根正丁醇提取物中分离得到的几个苷类化合物分别为璋牙菜苷，laganin,picraquassioside C葛根素，3-甲氧基葛根素，3,5-二羟基甲苯，3-O-β-D-葡萄糖苷，长春藤皂苷元3-O-β-D-葡萄糖吡喃-(1-3)-a-阿拉伯糖吡喃基苷28-O-β-D-葡萄糖吡喃基酯等。其中最重要的是用血糖溶血实验测得萱草根中还有含皂苷[11]。1.3.4 生物碱 秋水仙碱是茉莉生物碱，也是一种酚酮类生物碱，萱草的根、叶和花中均有较高的含量[12]。它的药理作用主要是抑制细胞有丝分裂，在这方面具有显著的效果，已在临床上用于乳腺癌、皮肤癌、白血病的治疗。1.3.5 萜类 一些研究者[13]从萱草根中分离得到21个化合物，其中7个为三萜类化合物,分别为3α-乙酰基-11-氧代-12-乌苏烯-24-羧酸、3-氧代羊毛甾-8,24-二烯-21-羧酸、3β-羟基羊毛甾-8,24-二烯-21-羧酸、3α-羟基羊毛甾-8,24-二烯-21-羧酸、α-乳香酸、β-乳香酸、11α-羟基-3-已酰基-β-乳香酸。1.4 萱草根的药理作用1.4.1 抗肿瘤作用 之所以萱草根对细胞有丝分裂具有明显的抑制作用，还在临床上已用于乳腺癌、皮肤癌、白血病的治疗，是因为萱草根中含有秋水仙碱，此外，萱草中含有的大黄素对肺癌A-549细胞DNA的生物合成具有明显的抑制作用[14]。1.4.2 抗菌作用 章谷生等[15]用化学方法分离萱草各组份，他从结果中首次发现，有较强的抗结核菌活力的是用乙醚提出的浸膏。继而从乙醚浸膏中提出5种组份，并进一步分出萱草毒素、萱草甲素、乙素、丙素和戊素等5种成分。上述各组份和成分在液体培养基中均有一定的抗结核菌能力，但是最为显著的是萱Ⅲ和萱Ⅳ，因其有效成分具耐热性，所以经加热破坏其毒性后，它还仍具抗菌能力。1.4.3 抗血吸虫的作用 蒽醌类化合物以及2-羟基大黄酚具有显著的抗血吸虫作用。分别能在15、14分钟这两个阶段中可以使所有的血吸虫幼虫完全凝固。所以，这类物质对有效药物的开发和血吸虫病的治疗会有很好的发展前景。1.5 蒽醌类化合物的提取方法1.5.1 水提取法 水提取法者们分析指出药物的热过程是与降解、水解蒽醌类成分有关，因为蒽醌类化合物之间相互转化。且蒽醌类成分容易受湿热影响，在有机相中较水中稳定，氧气可能参与其降解过程。而传统的水煎煮法，粉碎度对活性成分的提取率影响很大。水提取法者等的研究结果表明，药材总蒽醌提取物含量（3.11%）明显高于普通粉6号筛水提取物（1.09%）[16]。虽然超微粉碎能使植物的细胞壁破损、均匀草药的粒度、增大表面面积，也有利于化学成分溶出，但是在溶出化学成分时也有大量杂质。所以，一些研究者还尝试加入表面活性剂来提高对药材中总蒽醌的提取率。还一些研究人员研究了聚山梨酯85，聚山梨酯80，十二烷基硫酸钠（SDS），十二烷基磺酸钠等，且对比了对药材总蒽醌提取率范围的影响。他们发现了SDS对药材游离与结合蒽醌均有增溶作用，可大幅度提高药材中总蒽醌的提取率[17]。1.5.2 超声波提取法 超声波[18]是一种弹性机械振动波，可产生剧烈的振动，能破损植物细胞壁，加快化学因子的溶出，缩短提取时间，也避免了高温热敏感材料的影响，还具有产量高，设备简单，操作方便，节省时间和能源的特点。而且，近年来在中药有效成分提取中是经常使用的，所以有非常广阔的应用前景。有人用95%的乙醇作为溶剂，探究提取时间对该药材的粒度和蒽醌提取率的的影响，结果发现，超声提取药材粒度越小，总蒽醌提取率高 [19]。还有一些人用水作为溶剂，研究了对药材蒽醌提取率的影响因素，最后发现,如果提取时间相同，超声强度的增加，总蒽醌、游离蒽醌的提取率随其略有下降；超声强度相同时，如果超声时间增加，总蒽醌、游离蒽醌的提取率随其增大，但达到最高值时，再延长超声时间，提取率反而降低；因此优选出了以水为溶剂超声提取药材总蒽醌的条件，还通过正交法证明了超声提取时乙醇的提取率高于其他的方法。大量的研究表明：与水提取法相比，超声波辅助提取技术，优势明显，不仅实现对药提取制备生产工业化过程。而且在提取率、产品安全性等方面也是非常理想的一种方法。但是由于超声波是一种弹性机械振动波，可产生猛烈的振动，有可能会破坏药材的有效成分。所以它并不是理想的方法。1.5.3 微波萃取技术 微波是指频率在300～300K MHz的高频电磁波，它的穿透能力很强。微波萃取技术是基于微波加热和材料中目标组份的选择性萃取的一种新工艺。但它不同于普通的加热，而是对细胞直接作用，它是一种内部加热方式，所以它能增强和加速溶剂中溶质，从而提高溶解速度，达到更高的产量，但对微波萃取效率有很大影响的是溶剂的极性，这一点是值得注意的。最后，在许多的实验结果中发现，与总蒽醌的提取率和提取时间的比较，微波提取优于沸水和超声波法，它具有选择性好、提取效率高、溶剂耗量少、省时、节能、环保、设备简单、适应面广等优点，但由于在微波提取过程中总是以辐射状态直接加热植物细胞材料，它的有效成分可能导致变构，热敏性物质的分解，失效。所以，微波提取法对药材有效成分的药理功用和疗效有无影响，还需作进一步探究。1.5.4 超临界CO2萃取技术(SFE-CO2) 由于超临界CO2萃取技术具有双重液体和气体的特性，对许多物质具有很强的溶解能力，基本上不含有机溶剂。因此，超临界流体萃取法近年来备受青睐，因为它可能成为一种有望实现工业化生产的绿色中药提取新技术。其主要优点包括:适于热敏性物质提取，几乎无有机溶剂残留，提取效率高，产品质量稳定，流程简单，操作方便，节约能耗等。大部分常用的超临界流体二氧化碳，它可以接近常温。虽然具有很多优点但是也有一定的的选择性，较小的化合物容易提取。而对极性较大的SFE-CO2化合物萃取较难。此中草药中虽然含有游离蒽醌，但主要是以蒽醌甙为主，因此，超临界CO2萃取工艺参数也一直是人们关心的问题。一些研究者采用上述SFE-CO2萃取条件与传统溶剂法、超声提取法进行了比较，结果显示，SFE-CO2萃取法提取药材游离蒽醌的提取率高于其他方法，但由于药物主要是结合蒽醌，所以总蒽醌提取率最高的是超声法(2.448%)大于SFE法(1.884 %)和溶剂法(1.833 %)[20]。就目前的研究进展来分析，超临界流体萃取法萃取的蒽醌总数率并不高，是因为超临界CO2流体性质的有限所影响的，所以，许多研究者利用SFE-CO2萃取萱草根中蒽醌类物质，还的进一步研究温度和夹带剂种类及工艺参数对其影响。1.5.5 乙醇提取法 ? 乙醇提取法是指利用乙醇的溶解性，将乙醇作为溶剂对物质进行分离提纯的方法，此方法在提取中药的有效成分中广泛应用。因中药所含的化学成份十分复杂，既含有多种有效成份，又含有无效成份，也包含有毒成份。提取其有效成分需进一步加以分离、纯化，才能得到有效单体。而乙醇正好具备对细胞的穿透力强，醇提取液粘度小，易过滤，沸点低，浓缩回收方便简单，不容易发霉变质， 提取率比用其他方法高，生产周期短，流程简单，生产成本低等优点[21]。1.6 蒽醌的分离纯化方法研究 为了提高提取物的纯度，同时因现代制剂降低浸膏率的需要，研究者们在纯化萱草根中蒽醌类化合物的总提取物方面也作了大量研究，多采用大孔树脂、聚酰胺、明胶沉淀、醇调pH值、碱梯度提取法等方法，其中，研究较多、效果较好的是碱梯度提取法。如一些研究者对比研究了明胶沉淀、碱梯度提取法、聚酰胺以及大孔吸附树脂对萱草根中总蒽醌的富集作用，他们研究的结果是：碱梯度提取法对萱草根中总蒽醌富集效果最好[22]。其他的研究人员利用70%乙醇洗脱大孔吸附树脂，得到的结果是萱草根中的总蒽醌产量为80% [23]。1.6.1 大孔吸附树脂法 大孔吸附树脂具有多孔结构和很高的比表面积，可选择性地吸附有机物，具有选择性好、机械强度高、再生处理方便、吸附速度快等优点，在中药的提取、纯化方面应用价值较高。但不同型号的大孔吸附树脂具有不同的极性、孔径、比表面积、孔容等,因此其分离、富集效果也不同。同时，净化过程的影响也受了洗脱剂种类，浓度，体积，程序，流量等因素的影响，所以，提取分离萱草根中的蒽醌化合物时，对于不同类型的大孔吸附树脂的应用也不同。一些研究人员进行比较筛选，以获得高纯度的产品。1.6.2 pＨ值梯度萃取法 蒽醌类化合物不但有酚羟基且酸性强弱也各有差异，利用这个特点，继而对游离蒽醌采用pH值梯度萃取法进行分离纯化。如陈琼华等用20%硫酸溶液和氯仿的混合液水浴回流水解提取药材，氯仿提取液再相继以5%碳酸氢钠、5%氢氧化钠等溶液萃取后，分别酸化、分离得到大黄酸、大黄素等游离蒽醌[24]。王慧春等采用20%硫酸和氯仿的混合液，水浴回流水解、提取萱草根中的游离蒽醌，氯仿提取液再采用5%碳酸氢钠、5%碳酸钠、0.25%氢氧化钠和5%氢氧化钠分别萃取并进行分离纯化[25]。1.6.3 其他方法 此外，还可采用吸附柱色谱对萱草根中的蒽醌类化合物进行分离，常用的吸附剂有硅胶、聚酰胺、磷酸氢钙等。其中以硅胶为多，为了抑制蒽醌的解离，通常可在硅胶中加入少量草酸或柠檬酸。蒽醌苷还可采用葡聚糖凝胶色谱进行分离纯化。1.7 本实验的研究方案 经过对国内外近20年来的文献查阅、整理、分析与总结，从而得出相关萱草根药理功效以及萱草的主要成分为蒽醌和 2,5 -二氢呋喃酸胺衍生物。因其有上述的化学成分和药理功效[26]，所以萱草含有多种于人体有利的化学因素，具备极佳的营养价值及药用价值，以及其更重要的是应用于对血吸虫病的医治，也能抗结核、抗菌、抗肿瘤等；而萱草花的重要的药理作用是镇定安神，也具备抗抑郁、防止肝炎等功效。综上所述，从萱草根中提取并分离蒽醌类成分的方法是采用有机溶剂乙醇提取法提取萱草根中的蒽醌类物质和碱梯度萃取法提取分离不同酸性的蒽醌成分，因为采用这样的方法比其他的提取法明显提高了蒽醌类成分的提取率，缩短了提取时间。所以乙醇的提取率明显高于水、超声提取法、微波提取法、超零界二氧化碳提取法，因此目前多采用乙醇回流、渗滤等方式进行提取中药。从而本课题以萱草根为原料，以蒽醌类化合物的提取量为指标，采用有机溶剂乙醇提取法提取萱草根中的蒽醌类物质，再用碱梯度提取法分离萱草根中的蒽醌类化合物，并进行光谱分析鉴定，通过本课题的研究，旨在熟练掌握有机溶剂连续提取法、碱梯度提取法、重结晶等实验技术。 2 实验材料与方法2.1 实验材料和试剂 表2.1实验药品和试剂试剂名称规格生产厂家甲醇分析纯湖南师大化学试剂厂乙醇分析纯长沙安泰精细化工有限公司氯仿分析纯临沂市万泉化工厂醋酸镁分析纯国药集团化学试剂有限公司三氯化铁分析纯国药集团化学试剂有限公司硫酸分析纯株洲开发区石英化玻有限责任公司1，8-二羟基蒽醌对照品纯度>99%中国药品生物制品检定所萱草根药材药用咸阳市中药店乙醚分析纯天津市风船化学试剂技术有限公司盐酸分析纯西安旭煌生物技术有限公司碳酸氢钠分析纯天津福晨化学试剂厂氢氧化钠分析纯广东光华化学试剂厂丙酮分析纯广东台山粤侨化学试剂厂注释：萱草根药材经雷国莲教授鉴定确认2.2 实验仪器表2.2 实验主要仪器仪器名称仪器型号生产厂家多功能食物搅拌器JH300型广东顺德长兴塑料五金厂光学读数分析天平TG328A型湘仪天平仪器厂恒温水浴锅W20lB型上海申胜生物技术有限公司低温冷却液循环泵DLSB-5/20型郑州长城科工贸有限公司旋转蒸发器R-201型上海申生科技有限公司真空干燥箱DZF-6050型郑州长城科工贸有限公司电热恒温鼓风干燥箱DHG-9073型上海山连实验设备有限公司紫外可见分光光度计756-MC型上海精密科学仪器有限公司2.3 实验方法2.3.1 萱草根的处理 称取一定量的萱草根药材在80 ℃烘干，粉碎后过20目筛，备用。2.3.2 提取工艺 称取萱草根的原料药材(500 g)，加入4倍量乙醇，加热到乙醇沸点(保持微沸一定时间)，过滤收集乙醇提取液，余渣如上法提取2次(每次乙醇用量为2倍量)，合并滤馏回收乙醇，成浸膏，溶解浸膏(加入一定量沸水)，萃取(加入一定量醋酸乙液，浓缩至一定量，沉淀(加入2倍量乙醇)，静置过夜，过滤(除去杂质)，减压蒸酯)，收集醋酸乙酯溶液中不溶物质，如上法使用醋酸乙酯将不溶物质萃取3次，合并不溶物质，溶解(用一定量30%乙醇溶解收集的不溶物质)，等分3等份上述溶液备用。 2.3.3 碱梯度提取法分离 (1)大黄酸的分离：将含有游离蒽醌的乙醚溶液转移至分液漏斗，提取（用5%的碳酸氢钠水溶液一定量），分层放置，释放下层碳酸氢钠水溶液，放置入另一个三角烧瓶，同法操作两次，合并提取液，搅拌下滴入5 mol/L盐酸溶液，调pH值为2.0，稍放置沉淀，过滤，洗至中性，干燥，得大黄酸。 (2)大黄素的分离：留存在分液漏斗中的乙醚溶液，每次用5%碳酸钠水溶液一定量提取2～3次，直至提取液呈色较浅，合并碳酸钠提取液，滴入5 mol/L盐酸溶液，调pH值2.0，放置，沉淀完全，过滤，水洗至中性，干燥，得大黄素。 (3)大黄酚和大黄素甲醚混合物的分离：留存在分液漏斗中的乙醚溶液，以每次一定量2%氢氧化钠（pH=13）的水溶液提取2～3次，再用蒸馏水提取2次洗去碱液，合并氢氧化钠和水的提取液，滴入5 mol/L盐酸溶液，调pH值2.0，放置，使之沉淀完全，过滤，洗至中性，干燥，得大黄酚和大黄素甲醚混合物。2.3.4 蒽醌类化合物的鉴定 将产品进行UV分析,结果为232、253、287、355、423 nm,符合文献[27]给出的蒽醌类化合物的UV吸收谱带范围。同时将产品Borntrager进行显色反应,结果呈现紫红色，再将产品和醋酸镁反应呈现红色。从以上结果可以认为得到的产品是蒽醌类化合物。2.3.5 萱草根中蒽醌类化合物的含量测定 1、对照品标准溶液的制备精密称取1,8-二羟基蒽醌标准品10 mg,用甲醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，即为1,8-二羟基蒽醌对照品标准溶液(浓度为0.l mg/mL)。避光冷藏备用。2、1,8-二羟基蒽醌的紫外可见光谱移取1,8-二羟基蒽醌对照品标准溶液[28]于圆底烧瓶中，减压蒸馏回收甲醇，加0.5%醋酸镁-甲醇溶液使之显色，摇匀使之溶解，定容于10 mL容量瓶中。取其溶液于450-700 nm范围内扫描其紫外可见吸收光谱，确定其最大吸收波长。3、标准曲线的绘制方法精密移取1,8-二羟基蒽醌对照品标准溶液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL减压蒸馏回收甲醇，加0.5%醋酸镁-甲醇溶液使之显色，摇匀使之溶解，定容于10 mL容量瓶中，以0.5%醋酸镁-甲醇溶液作空白液，在最大吸收波长处测量其吸光度，以吸光度(A)对浓度(C)作标准曲线并拟合出线性回归方程。4、稳定性实验 精密移取1,8-二羟基蒽醌对照品标准溶液(浓度为0.1 mg/mL)1.0 mL，减压蒸馏回收甲醇，加0.5%醋酸镁-甲醇溶液使之显色，摇匀使之溶解，定容于10 mL容量瓶中，在2.5小时内每间隔0.5小时测定一次吸光度并计算其相对标准偏差RSD(RSD=标准偏差/平均值)。5、加样回收率实验 精密移取5份样品制备液各1.0 mL，加入1,8-二羟基蒽醌对照品标准溶液(浓度为0.1 mg/mL)2.0 mL，减压蒸馏回收甲醇，加0.5%醋酸镁-甲醇溶液使之显色，摇匀使之溶解，定容于25 mL容量瓶中，测定其吸光度，并计算出加样回收率及相对标准偏差RSD(RSD=标准偏差/平均值)。3 结果与分析3.1 1,8-二羟基蒽醌最大吸收峰的确定 图3.1 1,8-二羟基蒽醌甲醇溶液的紫外可见吸收光谱图3.2 1,8-二羟基蒽醌醋酸镁溶液的紫外可见吸收光谱 由图3.1及图3.2可见1,8-二羟基蒽醌的甲醇溶液最大吸收波长为561 nm处。加入0.5%醋酸镁-甲醇溶液显色后，其最大吸收波长移至506 nm处。因此,在后续的检测中选定506 nm为检测波长。3.2 标准曲线的绘制 图3.3 1,8-二羟基蒽醌标准曲线 图3.3为1,8-二羟基蒽醌对照品标准溶液加入0.5%醋酸镁-甲醇溶液显色后的标准曲线图。从图中可以看出，吸光度与浓度存在正比的关系，拟合得线性回归方程:A=27.70C+0.0057，相关系数R2=0.9995，表明吸光度A与蒽醌类化合物浓度C在0.005-0.025 mg/mL范围内呈现良好的线性关系。3.3稳定性试验结果 表3.3为稳定性实验结果，从表中可以看出在2小时测定5次吸光度平均值0.283符合线性回归方程，每次测定吸光度的数值变化不大且稳定性结果的RSD为0.4%,表明紫外-可见分光光度法测定蒽醌类化合物具有很高的稳定性。表3.3 稳定性考察时间/小时00.51.01.52.0平均值RSD%吸光度0.2830.2820.2840.2840.2820.2830.43.4重现性实验结果 表3.4为重现性试验结果，从表中可以看出平均吸光度为0.283符合线性回归方程，平行5次测试的吸光度数值变化不大且重现性实验结果的RSD仅为0.3%,表明紫外-可见分光光度法测定蒽醌类化合物具有很好的重现性。表3.4 重现性实验实验号12345平均值RSD%吸光度0.2830.2840.2830.2840.2830.2830.33.5加样回收率实验结果表3.5为加样回收率实验结果，从表中可以看出5次实验的回收率变化不大且平均加样回收率为99.8%,RSD为0.8%。表明紫外-可见分光光度法测定蒽醌类化合物具有很好的准确性。表3.5 加样回收率试验编号样品中含量(mg)加对照品量(mg)实际测定值(mg)回收率(%)RSD(%)10.1560.2000.359100.620.1540.2000.35199.230.1530.2000.35199.40.840.1580.2000.36299.250.1590.2000.362100.83.6蒽醌类化合物乙醇浸提条件的选择 在乙醇浸提法提取萱草根蒽醌类化合物的过程中,提取时间、乙醇浓度、料液比、提取温度等因素都会对提取率有比较大的影响。通过单因素实验，确定了对萱草根蒽醌类化合物最佳提取条件。3.6.1 提取温度对提取效果的影响 表3.6 提取温度对蒽醌化合物提取率的影响提取温度(℃)1020304050吸光度(A)0.3450.4320.7860.6350.612图3.4 提取温度对蒽醌化合物提取率的影响 由图3.4可知，由于适当的加温，可以促使细胞内的活性成分运动加剧从而有利于蒽醌类化合物的溶出，也促使提取效率的增加。当温度低于30 ℃时，萱草根中总蒽醌类化合物和游离态蒽醌类化合物的提取率都随温度升高而增加,当温度达到30 ℃时，提取率达到最大。由于温度过高时，会引起乙醇的挥发及游离态蒽醌类化合物的氧化而降低总蒽醌类化合物的提取率。因此,随着温度的继续升高，则提取率呈现下降趋势。所以确定30 ℃为最佳提取温度。3.6.2 提取液乙醇浓度对提取效果的影响 表3.7 乙醇浓度对蒽醌化合物提取率的影响乙醇浓度(%)4050607080吸光度(A)0.3120.3340.8320.7450.613图3.5 乙醇浓度对蒽醌化合物提取率的影响 由图3.5可知，当乙醇浓度小于60%时，随着乙醇浓度的增大，萱草根中的蒽醌类化合物的提取率增大。当乙醇浓度大于60%时，萱草根中的蒽醌类化合物的提取率反而呈下降趋势。由于低浓度乙醇溶液可以促进蒽醌苷的溶出，而高浓度的乙醇溶液则会使蒽醌苷沉淀出来，不利于总蒽醌类化合物的溶出。此外，游离态蒽醌类化合物的提取效率随着乙醇浓度的增大而增大(游离态蒽醌溶于乙醇不溶于水)。综合考虑选择60%乙醇作为提取剂的浓度。3.6.3料液比对提取率的影响表3.8 配料比对蒽醌类化合物的影响料液比1:81:91:101:111:12吸光度(A)0.4120.5130.7980.6320.431图3.6 配料比对蒽醌类化合物的影响由图3.6可知，萱草根中总蒽醌类化合物及游离态蒽醌类化合物的提取率随着料液比的增大而增加，而且增加效果很明显。但是，当料液比为1:8后提取率增加的趋势放缓。推断原因是随着料液比的增加，可以使细胞内外蒽醌类化合物的浓度变低，有利于活性成分的溶出。但从经济角度出发，料液比的增高会增加浓缩工作量。综合考虑选择料液比为1:10。3.6.4提取时间对提取率的影响表3.9 提取时间对蒽醌化合物提取率的影响提取时间(小时)45678吸光度(A)0.3210.3560.7890.6430.521图3.7 提取时间对蒽醌化合物提取率的影响 由图3.7可知，萱草蒽醌类化合物的提取效率随着时间的延长而增大。但是，当提取时间超过6小时后，萱草蒽醌类化合物的提取效率增大的趋势放缓逐步达到最大。这是由于细胞内外蒽醌类化合物浓度差的减小，造成活性成分的扩散作用减弱，从而导致提取效率的减小。因此,最佳的提取时间为6小时。结 论萱草根中蒽醌类的提取方法主要有有机溶剂萃取法、超临界流体萃取法、超声波萃取法和微波辅助萃取法等。而有机溶剂萃取法是国内外利用最广泛的方法之一，甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正己烷以及它们的水溶液或混合溶液是此法经常使用的溶剂。有研究显示，以甲醇和乙醇为提取溶剂时，提取效果最好。 该方法具有提取率高，杂质少，无毒，易于实现工业化生产等，可与溶剂分离，吸附树脂，离心浓缩，絮凝沉淀和膜技术结合使用。用碱梯度提取法从萱草根中提取分离出蒽醌类化合物，采用紫外可见分光光度法，以0.5%醋酸镁-甲醇溶液为显色剂，直接测定提取液中蒽醌类化合物的含量。通过在450-700 nm范围内进行紫外可见扫描，确定了506 nm为最大吸收波长，该方法操作简单，适合在提取生产中方便快捷、准确检测出蒽醌类化合物的含量，继而达到分离纯化的目的，为后续综合开发利用奠定可靠的基础。 经过试验确定从萱草根中提取蒽醌类化合物的较佳的工艺条件为：乙醇浓度为60%，料液比为1:10，浸提温度为30 ℃，每次6小时，提取率达94%。参考文献[1] 杨中铎, 李援朝. 萱草根化学成分的分离与结构鉴定[J]. 中国药物化学杂志，2003, 13(1): 34-35.[2] 王云峰, 赵丽晶, 徐博等. 萱草花的营养成分和生物活性研究进展[J]. 吉林医药学学报, 2012, 33(1): 47-49. 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