电化物传感器的构建及其在卡那霉素残留检测中的应用
：卡那霉素是一种广谱碱性氨基糖苷类抗生素。本研究基于核酸适配体引发的核酸外切酶Ⅲ循环酶切，构建了适用于卡那霉素超灵敏检测的无标记电化学生物传感器。实验中，首先将与卡那霉素适配体完全互补配对的DNA（cDNA）自组装修饰于金电极表面。紧接着，在体系中加入少量卡那霉素适配体，使其与电极表面的部分cDNA杂交形成双链。当检测体系中不存在卡那霉素时，加入核酸外切酶Ⅲ可引发其对双链DNA中cDNA 3’末端的逐步水解，使得杂交双链中的卡那霉素核酸适配体得以释放，继而引发一个新的杂交和酶切的循环周期，最终导致电极界面修饰的cDNA被完全切割。当在检测体系中存在卡那霉素时，卡那霉素和核酸适配体的结合会阻碍以上的循环酶切过程，使得电极界面修饰的cDNA得以保留，且保留量与卡那霉素的浓度呈正比。以六氨合钌为电化学信号分子，通过电化学定量电极表面保留的cDNA含量，即可实现待测体系中卡那霉素浓度的检测。该电化学生物传感器具有良好的敏感性、准确性和特异性，可实现1-500 pM范围内卡那霉素的检测，其检测限低至1 pM。实验结果证实，该电化学生物传感器适用于牛奶中卡那霉素含量的检测。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 2
1 引言 2
1.1卡那霉素概述及其残留危害 2
1.2核酸适配体概述及其特点 2
1.3卡那霉素的现有检测方法 2
1.4生物传感器及其在卡那霉素检测中的应用 3
1.4.1生物传感器 3
1.4.2常见的卡那霉素生物传感器 3
1.4.3基于核酸外切酶Ⅲ的信号放大系统在传感器中的应用 4
1.5本文研究 5
2 材料与方法 5
2.1材料 5
2.1.1实验药品 5
2.1.2实验溶液 5
2.1.3适配体及其互补序列 6
2.1.4实验仪器 6
2.2 方法 6
2.2.1金电极表面预处理 6
2.2.2 cDNA修饰金电极 6
2.2.3 Kaptamer引发Exo Ⅲ循环酶切 6
2.
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
2.4电化学定量检测 6
2.2.5检测牛奶样品中卡那霉素浓度 6
3 结果 6
3.1 该传感器的阻抗谱表征 7
3.2 该传感器的信号放大性能 8
3.3 优化该传感器的检测性能 8
3.4卡那霉素浓度检测范围的确定 9
3.5该传感器特异性和稳定性的验证 10
3.6该传感器应用的分析 10
4 讨论 11
致谢 12
参考文献 12
电化学生物传感器的构建及其在卡那霉素残留检测中的应用
引言
1 引言
抗生素应用于畜牧业以来，使养殖产业得到很大的裨益[1]。人们追求高产出高收入而大量投用抗生素，使动物源性食品中残留抗生素的风险大大提高，因此，对此类食品安全问题也愈发被重视，而动物源性食品中抗生素残留量的检测方法亟待完善。本研究旨在将生物传感技术、适体筛选技术进行联合，以卡那霉素为检测对象，建立基于适配体的抗生素残留检测的新型电化学生物传感器，并将其应用于实际动物源性食品的检测。
1.1卡那霉素概述及其残留危害
卡那霉素，一种广谱碱性氨基糖苷类抗生素，具有水溶性强、对革兰氏阴性杆菌作用强而持久、低廉等优点，是一种重要的抗感染药物。因其能够有效抑制细菌蛋白质合成的全过程，在临床上广泛使用[26]。目前，我国畜牧业、农业和水产业中也将卡那霉素作为一种常用的肌肉注射兽药，用于治疗多数革兰氏阴性杆菌和部分耐青霉素金黄色葡萄球菌所引起的感染，如呼吸道、肠道和泌尿道感染，乳腺炎、禽霍乱和雏鸡白痢等[7, 8]。此外，亦可用于治疗猪地方性流行性肺炎、猪萎缩性鼻炎。长期饮用含卡那霉素过量残留的牛奶，可使体内某些细菌产生耐药性影响抗菌药物的治疗效果，并引起敏感人群的致敏反应及耳毒性、肾毒性。此外，牛乳中抗生素的残留会抑制乳制品的发酵，给乳制品加工产业带来经济损失。因此，各国相继规定了食品中卡那霉素的最大残留限量（MRL），其中欧盟牛奶中卡那霉素的残留限量为150 μgkg1[9]。
1.2核酸适配体概述及其特点
核酸适配体是一种通过指数富集的配基系统进化技术（SELEX技术）筛选得到的具有特定空间结构的单链DNA或RNA序列[10]。核酸适配体对不同的靶标分子，包括小分子、蛋白质甚至细胞，都具有高特异性和亲和性[11]。由于适配体具有良好的稳定性、易修饰性、高亲和性和特异性等优点，常将其作为抗体的有效替代运用于各类检测体系[12]。因此，随着卡那霉素适配体（Kaptamer）的发现，基于核酸适配体检测卡那霉素残留的分析方法得到了迅速发展。
1.3卡那霉素的现有检测方法
为实现对卡那霉素残留量的灵敏检测，开发更简便的方法一直是研究的热点[1317]。现有的卡那霉素检测方法主要包括（1）微生物检测法：根据抗生素对微生物生理机能、代谢的抑制作用来分析样品中的抗生素残留。黄晓蓉等利用阻抗变化测定微生物的代谢活动，当培养基中微生物代谢发生变化时，阻抗也相应发生改变，通过阻抗分析法来快速检测牛奶中抗生素残留[18]。（2）理化检测法：利用卡那霉素分子本身所具有的特殊反应或理化性质对其进行定性、定量分析，如高效液相色谱法、气相色谱法、毛细管电泳法、联用技术。在牛奶中抗生素残留检测方面，最常用的理化检测方法是高效液相色谱和联用技术。Chen等[19]利用柱后衍生化 HPLC 对卡那霉素A进行检测，检测限至0.3 μgmL1。其灵敏度高，但检测程序较复杂，较难推广。（3）免疫检测法：利用抗原与抗体的特异性结合反应进行分析检测。Jin等[20]利用竞争ELISA法，可以对活体动物血清中卡那霉素含量进行检测，其检测限为1.4 ngmL1，这种方法对牛奶中残留卡那霉素的检测限为1.0 ngmL1。然而，这类方法由于抗生素之间较易发生交叉反应，所以交叉反应率较高。（4）生物传感器检测法（见1.4）
1.4生物传感器及其在卡那霉素检测中的应用
1.4.1生物传感器
生物传感器是在分子识别元件和待测物质特异性结合后，通过信号转换器将其浓度转化为电信号进行分析检测的仪器[21]。
1.4.2常见的卡那霉素生物传感器
金纳米颗粒是一种尺度在纳米级别范围的金属纳米颗粒，因具有高电子密度、易于表面修饰、不影响生物大分子的活性、高灵敏度等特点而常用作于信号标记物。Song等[22]利用金纳米颗粒结合SELEX技术构建一种光学传感器对卡那霉素进行检测（图11），实现了卡那霉素在溶液中的可视检测，其检测限低至15 ngmL1。
图11 基于DNA适配体的卡那霉素可视生物传感器
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 2
1 引言 2
1.1卡那霉素概述及其残留危害 2
1.2核酸适配体概述及其特点 2
1.3卡那霉素的现有检测方法 2
1.4生物传感器及其在卡那霉素检测中的应用 3
1.4.1生物传感器 3
1.4.2常见的卡那霉素生物传感器 3
1.4.3基于核酸外切酶Ⅲ的信号放大系统在传感器中的应用 4
1.5本文研究 5
2 材料与方法 5
2.1材料 5
2.1.1实验药品 5
2.1.2实验溶液 5
2.1.3适配体及其互补序列 6
2.1.4实验仪器 6
2.2 方法 6
2.2.1金电极表面预处理 6
2.2.2 cDNA修饰金电极 6
2.2.3 Kaptamer引发Exo Ⅲ循环酶切 6
2.
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
2.4电化学定量检测 6
2.2.5检测牛奶样品中卡那霉素浓度 6
3 结果 6
3.1 该传感器的阻抗谱表征 7
3.2 该传感器的信号放大性能 8
3.3 优化该传感器的检测性能 8
3.4卡那霉素浓度检测范围的确定 9
3.5该传感器特异性和稳定性的验证 10
3.6该传感器应用的分析 10
4 讨论 11
致谢 12
参考文献 12
电化学生物传感器的构建及其在卡那霉素残留检测中的应用
引言
1 引言
抗生素应用于畜牧业以来，使养殖产业得到很大的裨益[1]。人们追求高产出高收入而大量投用抗生素，使动物源性食品中残留抗生素的风险大大提高，因此，对此类食品安全问题也愈发被重视，而动物源性食品中抗生素残留量的检测方法亟待完善。本研究旨在将生物传感技术、适体筛选技术进行联合，以卡那霉素为检测对象，建立基于适配体的抗生素残留检测的新型电化学生物传感器，并将其应用于实际动物源性食品的检测。
1.1卡那霉素概述及其残留危害
卡那霉素，一种广谱碱性氨基糖苷类抗生素，具有水溶性强、对革兰氏阴性杆菌作用强而持久、低廉等优点，是一种重要的抗感染药物。因其能够有效抑制细菌蛋白质合成的全过程，在临床上广泛使用[26]。目前，我国畜牧业、农业和水产业中也将卡那霉素作为一种常用的肌肉注射兽药，用于治疗多数革兰氏阴性杆菌和部分耐青霉素金黄色葡萄球菌所引起的感染，如呼吸道、肠道和泌尿道感染，乳腺炎、禽霍乱和雏鸡白痢等[7, 8]。此外，亦可用于治疗猪地方性流行性肺炎、猪萎缩性鼻炎。长期饮用含卡那霉素过量残留的牛奶，可使体内某些细菌产生耐药性影响抗菌药物的治疗效果，并引起敏感人群的致敏反应及耳毒性、肾毒性。此外，牛乳中抗生素的残留会抑制乳制品的发酵，给乳制品加工产业带来经济损失。因此，各国相继规定了食品中卡那霉素的最大残留限量（MRL），其中欧盟牛奶中卡那霉素的残留限量为150 μgkg1[9]。
1.2核酸适配体概述及其特点
核酸适配体是一种通过指数富集的配基系统进化技术（SELEX技术）筛选得到的具有特定空间结构的单链DNA或RNA序列[10]。核酸适配体对不同的靶标分子，包括小分子、蛋白质甚至细胞，都具有高特异性和亲和性[11]。由于适配体具有良好的稳定性、易修饰性、高亲和性和特异性等优点，常将其作为抗体的有效替代运用于各类检测体系[12]。因此，随着卡那霉素适配体（Kaptamer）的发现，基于核酸适配体检测卡那霉素残留的分析方法得到了迅速发展。
1.3卡那霉素的现有检测方法
为实现对卡那霉素残留量的灵敏检测，开发更简便的方法一直是研究的热点[1317]。现有的卡那霉素检测方法主要包括（1）微生物检测法：根据抗生素对微生物生理机能、代谢的抑制作用来分析样品中的抗生素残留。黄晓蓉等利用阻抗变化测定微生物的代谢活动，当培养基中微生物代谢发生变化时，阻抗也相应发生改变，通过阻抗分析法来快速检测牛奶中抗生素残留[18]。（2）理化检测法：利用卡那霉素分子本身所具有的特殊反应或理化性质对其进行定性、定量分析，如高效液相色谱法、气相色谱法、毛细管电泳法、联用技术。在牛奶中抗生素残留检测方面，最常用的理化检测方法是高效液相色谱和联用技术。Chen等[19]利用柱后衍生化 HPLC 对卡那霉素A进行检测，检测限至0.3 μgmL1。其灵敏度高，但检测程序较复杂，较难推广。（3）免疫检测法：利用抗原与抗体的特异性结合反应进行分析检测。Jin等[20]利用竞争ELISA法，可以对活体动物血清中卡那霉素含量进行检测，其检测限为1.4 ngmL1，这种方法对牛奶中残留卡那霉素的检测限为1.0 ngmL1。然而，这类方法由于抗生素之间较易发生交叉反应，所以交叉反应率较高。（4）生物传感器检测法（见1.4）
1.4生物传感器及其在卡那霉素检测中的应用
1.4.1生物传感器
生物传感器是在分子识别元件和待测物质特异性结合后，通过信号转换器将其浓度转化为电信号进行分析检测的仪器[21]。
1.4.2常见的卡那霉素生物传感器
金纳米颗粒是一种尺度在纳米级别范围的金属纳米颗粒，因具有高电子密度、易于表面修饰、不影响生物大分子的活性、高灵敏度等特点而常用作于信号标记物。Song等[22]利用金纳米颗粒结合SELEX技术构建一种光学传感器对卡那霉素进行检测（图11），实现了卡那霉素在溶液中的可视检测，其检测限低至15 ngmL1。
图11 基于DNA适配体的卡那霉素可视生物传感器
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/yxlw/dwyx/899.html
